家蠶細小病毒樣病毒(中國株)主要基因的表達動態(tài)及定位.pdf

1、家蠶細小病毒樣病毒(Bombyx mori parvo-likevirus,BmPLV)是一種二分病毒。該病毒在家蠶中腸柱狀細胞核內進行復制和包裝,感染的細胞核呈現過分膨脹、細胞核孚爾根濃染等細胞病理學特征。病毒粒子直徑20～24nm,無囊膜呈球型,衣殼呈二十面體對稱結構。其基因組為單鏈線性雙分子DNA(VDI、VD2),大小分別是6.6kb、6.1kb,分別獨立包裝在各自的衣殼中。該病毒基因組編碼四個非結構蛋白NS1、NS2、NS3和

2、pol(DNApolymerase),一個主要結構蛋白VP和一個次要結構蛋白P133。VD1、VD2末端具有的反向重復序列可形成與BmPLV復制有關的“鍋柄形”結構以及含自身編碼DNA聚合酶序列,推測該病毒基因組的復制方式與腺病毒相類似,以末端結合蛋白為起始復合物開始復制的。家蠶細小病毒樣病毒粒子的特征研究仍然停留在比較原始的狀態(tài),缺乏更精細的外觀研究。所以本實驗從病毒的結構特征著手進行相關的研究,進而對病毒粒子結構蛋白組分及衣殼蛋白排

3、布情況作了解析及推測。此外,由于DNA聚合酶是病毒基因組復制表達所必須的早期蛋白而VP蛋白在病毒粒子衣殼裝配中所必須的且是衣殼主要組成部分,所以通過對DNA聚合酶和VP蛋白研究可以說明病毒粒子在家蠶中腸增殖過程中的表達動態(tài)及定位情況。
　　 1、病毒粒子的電鏡觀察
　　 將感病家蠶蠶糞進行勻漿、粗濾、硫酸銨沉淀等粗提,以便去除病毒液中的色素、脂質和雜蛋白等雜質。再經蔗糖和氯化銫兩步密度梯度離心等精提,獲取高純度病毒粒子。

4、經透析后的病毒粒子進行2%磷鎢酸負染后,用透射電鏡進行觀察。在電鏡下放大400,000倍可觀察到病毒粒子呈現均一的球形結構,直徑約為22nm,表面有許多小子粒凸起。其外觀結構跟犬細小病毒相類似,在表面有囊突結構,凹凸花紋也與犬細小病毒粒子的相似,它的表面最突出的特點是按五重軸方向觀看有凸起感,在定點處有尖刺狀結構,據此推測衣殼蛋白可能是5-3-2對稱的,按T=1的對稱二十面體結構排列。提純的病毒粒子在氯化銫高鹽低溫環(huán)境放置30天后的病毒

5、也均勻排布,但是結構不夠完整,出現空殼結構或者部分片狀結構。
　　 2、結構蛋白組分
　　 利用SDS-PAGE電泳分離技術對提純的病毒粒子進行蛋白組分分析,比較病毒結構蛋白的差異。實驗結果顯示,冷凍處理病毒粒子蛋白分析有2蛋白條帶,大小分別是55kDa、53kDa;而經過高鹽處理的病毒粒子蛋白分析卻有4個條帶,大小為55kDa、53kDa、29kDa、26kDa。高鹽降解處理的病毒粒子蛋白組分要比冷凍儲存的病毒粒子結構

6、蛋白組分多,29kDa、26kDa條帶在完整病毒液中均未檢測到。對高鹽降解的蛋白條帶進行質譜鑒定,結果顯示是病毒結構蛋白。未檢測到的蛋白的現象與犬細小病毒的結構蛋白消失現象有極大淵源。
　　 3、vp和pol在家蠶中腸增殖過程中的表達動態(tài)及定位
　　 本實驗主要采用組織冷凍切片和免疫熒光反應技術,檢測該病毒進入中腸后主要基因表達動態(tài)。首先,選擇對病毒敏感品種華八三五和具有抗性的秋豐。桑葉飼養(yǎng)幼蟲至四齡,在四齡起蠶12h進

7、行涂葉添毒,分別在0h-144h十個時間點剖取中腸組織。其次,家蠶中腸經多聚甲醛固定后在20%蔗糖中保存。去處理過的中腸組織用OCT冷凍包埋并進行切片。最后,用VP、pol抗體和綠色熒光二抗FITC顯色,同時用藍色熒光DAPI作為核定位參考內參,用熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡觀察。結果顯示:
　　 1)、pol基因表達動態(tài)及定位:華八三五添毒36h,中腸柱狀細胞中可觀察到綠色熒光信號,熒光信號都集中在核的位置處,而秋豐未檢測