兩株豬細(xì)小病毒的分子特征及其主要蛋白的原核表達(dá).pdf

1、豬細(xì)小病毒(porcineparvovirus，PPV)能夠?qū)е履肛i的繁殖障礙，給世界各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對(duì)PPV主要結(jié)構(gòu)蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的研究很多，但針對(duì)PPV全基因組的研究很少，GenBank中收錄的完整的PPV全基因組序列只有兩條(GenBankno.U44978和NC_001718)，因此，本論文對(duì)實(shí)驗(yàn)室分離的兩株豬細(xì)小病毒(LXB-PPV-20-06和LXB-PPV-16-06)進(jìn)行全基因組序列

2、測(cè)定，以分析這兩株豬細(xì)小病毒基因組的分子特征，并結(jié)合GenBank中收錄的我國(guó)及國(guó)外的豬細(xì)小病毒序列，對(duì)豬細(xì)小病毒的遺傳變異做一分析，并對(duì)LXB-PPV-20-06株主要的非結(jié)構(gòu)蛋白NS1蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白VP2進(jìn)行原核表達(dá)。 通過(guò)設(shè)計(jì)涵蓋PPV全基因組的7對(duì)引物，分段克隆PPV的基因組片段，將PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送大連寶生物工程公司測(cè)序。結(jié)果表明LXB-PPV-20-06株和LXB-PPV-16-06株基因組全長(zhǎng)分別為501

3、3nt和5031nt，其編碼區(qū)均不存在堿基的插入與缺失，但在VP1/VP2終止密碼子處的非編碼區(qū)存在不同程度的堿基缺失，分別缺少63nt和45nt，推測(cè)可能與毒力變化有關(guān)。NS1基因及編碼蛋白的多序列比對(duì)表明LXB-PPV-20-06株與美國(guó)Kresse株和我國(guó)的NJ株同源性最高，均為99.4％，PPV-16-06株與我國(guó)的SY-99株同源性最高。只有一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的差異；VP2基因及編碼蛋白的多序列比對(duì)表明PPV-20-06株與Kre

4、sse株同源性最高，其編碼氨基酸序列完全一致，LXB-PPV-16-06株與LJL-12株同源性最高。根據(jù)VP2蛋白的多序列比對(duì)結(jié)果以及VP2蛋白215位、378位、383位、436位和565位氨基酸位點(diǎn)的變異情況，發(fā)現(xiàn)PPV感染的臨床病理型與VP2蛋白這些位點(diǎn)的變異情況密切相關(guān)。遺傳進(jìn)化分析表明，我國(guó)的豬細(xì)小病毒流行毒株在進(jìn)化樹上比較接近。 通過(guò)PCR擴(kuò)增LXB-PPV-20-06株NS1基因和VP2基因全序列，經(jīng)酶切之后，克

5、隆至pET-32a(+)載體上，經(jīng)PCR、酶切鑒定，篩選重組表達(dá)質(zhì)粒pET-NS1和pET-VP2，將陽(yáng)性重組子送公司測(cè)序，經(jīng)序列分析進(jìn)一步驗(yàn)證重組子構(gòu)建。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)中，經(jīng)總濃度為1mmol/LIPTG誘導(dǎo)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示PPV-LXB-20-06株NS1基因和VP2基因均獲得了良好的表達(dá)，用鎳柱對(duì)融合蛋白進(jìn)行純化，融合表達(dá)的NS1蛋白的分子量接近97kDa，融合表達(dá)的VP