豬細(xì)小病毒SC1株非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因的原核表達(dá)及PPA-NS1-ELISA方法的初步建立.pdf

1、本研究對(duì)已經(jīng)構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pPNS1通過EcoRⅠ+HindⅢ雙酶切后，亞克隆進(jìn)原核表達(dá)載體PET30a(+)中，構(gòu)建了一株重組表達(dá)質(zhì)粒PET-NS1；對(duì)PET-NS1進(jìn)行酶切、菌落PCR、光生物素標(biāo)記分子雜交以及測(cè)序分析鑒定，表明該重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建確實(shí)可靠；將其轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主菌BL21中，通過IPTG的誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明重組NS1蛋白得以高效表達(dá)，以包涵體形式存在，占細(xì)菌總蛋白的26.7％。并確定了NS1蛋白的最佳

2、誘導(dǎo)條件：IPTG終濃度為0.6mM，誘導(dǎo)時(shí)間為3h。Western-Blot鑒定NS1蛋白分子量約86.0KD，具有抗原性。　　大量表達(dá)的重組蛋白經(jīng)純化后作為抗原，包被酶標(biāo)板，以辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白作為二抗，建立了辣根過氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(PPA-NS1-ELISA)檢測(cè)方法。經(jīng)檢測(cè)抗原最佳包被濃度為33ug/ml，血清最佳稀釋度為1：40，陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)初步確定為：OD490待檢血清＞0.30。與豬