家蠶濃核病毒中國株非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的初步研究.pdf

1、家蠶濃核病毒中國株(BmDNV-3)屬于昆蟲細(xì)小病毒。細(xì)小病毒科的NS1蛋白具有解旋酶、ATP酶活性和切割活性，NS1的這些功能是其參與病毒基因組DNA復(fù)制和調(diào)控病毒其他基因表達(dá)所必須的，NSl蛋白還具有細(xì)胞毒性的功能。在本實(shí)驗(yàn)室對家蠶濃核病毒中國株(BmDNV-3)基因組序列測序完成以后，發(fā)現(xiàn)BmDNV-3的基因組結(jié)構(gòu)與其他細(xì)小病毒有很大差別，并且該病毒擁有其他細(xì)小病毒都不具有的DNA聚合酶，暗示了它可能具有與其他細(xì)小病毒不同的復(fù)制方

2、式。研究家蠶濃核病毒中國株(BmDNV-3)NSl蛋白的功能就顯得尤為重要。為了解明BmDNV-3 NS1蛋白在病毒生命周期中所起的作用，本文首先對BmDNV-3NSl基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并進(jìn)行了表達(dá)研究。主要結(jié)論如下： 1、利用PROSITE軟件、Supeffamily 1.69軟件和Motif scan軟件對BmDNV-3 NS1蛋白的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)進(jìn)行分析，得到BmDNV-3NSZ基因全長為950bp，其編碼蛋白分

3、子量為36.52kDa；NS1蛋白具有解旋酶超家族3和ATP酶的功能域，表明BmDNV-3 NS1蛋白可能參與病毒基因組DNA的復(fù)制功能。 2、對家蠶5齡幼蟲經(jīng)口接種BmDNV-3病毒，分不同的時間段提取感染幼蟲的中腸組織，提取組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，對BmDNV-3 NS1基因用RT-PCR進(jìn)行半定量分析，分析結(jié)果表明NS1基因在6h．p.i.開始轉(zhuǎn)錄，在24-48h．p.i.時．NS1基因持續(xù)高水平轉(zhuǎn)錄，并且在72

4、h．p.i.病毒復(fù)制完成以后仍然有NS1基因的轉(zhuǎn)錄。說明NS1蛋白在病毒基因組。DNA復(fù)制期間大量表達(dá)，參與病毒基因組的復(fù)制，并且可能參與病毒的裝配等過程。 3、利用基因重組技術(shù)將BmDNV-3NS1片段克隆到pMD-18T載體上。通過酶切將NS1片段連接到pET-30a原核表達(dá)載體上，在適當(dāng)?shù)腎PTG濃度下誘導(dǎo)NS1蛋白表達(dá)，經(jīng)Western blot分析和質(zhì)譜鑒定，表達(dá)的產(chǎn)物為BmDNV-3 NS1蛋白，分子量大小約為36.

5、4kDa．。通過Ni-NTA柱過濾純化得到的純NS1蛋白用于免疫新西蘭大白兔，制備兔多克隆抗體，并用抗體純化試劑盒純化所獲得的NS1多克隆抗體。 4、利用家蠶桿狀病毒表達(dá)載體在家蠶細(xì)胞和蟲體中表達(dá)NS1蛋白。將NS1和報(bào)告基因EGFP片段連接到pFastBacHTb家蠶桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上。將轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTb-NS1-EGFP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BmBacDH10感受態(tài)細(xì)胞，獲得bacmid-NS1-EGFP的基因組。該基因