家蠶濃核病毒BmDNV-1(伊那)株結(jié)構(gòu)蛋白基因VP4的克隆表達(dá)及抗體制備.pdf

1、細(xì)小病毒科根據(jù)病毒的宿主不同，分成兩個(gè)亞科，即感染脊椎動(dòng)物的細(xì)小病毒亞科（Parvovirinae）和感染無脊椎動(dòng)物的濃病毒亞科（Densovirinae）。其特征是病毒粒子無囊膜，直徑約18～26nm，二十面體對(duì)稱，衣殼由約32個(gè)長(zhǎng)3～4nm的殼粒構(gòu)成。病毒內(nèi)含有正負(fù)鏈單分子ssDNA，極性或?yàn)檎湥驗(yàn)榛パa(bǔ)的負(fù)鏈。 濃核病毒（Densoviruses，DNVs）亞科有分為4個(gè)屬，即濃核病毒屬（Densovirus）、短病毒屬

2、（Brevidensovirus）、重復(fù)病毒屬（Iteravirus）和環(huán)星黑煙濃核病毒屬（Pefudensovirus）。其病毒基因組為單鏈，線型的DNA，大小約4～6 kb，末端反向重復(fù)形成反轉(zhuǎn)回文結(jié)構(gòu)，其中基因組末端的反轉(zhuǎn)互補(bǔ)的回折部分是細(xì)小病毒DNA復(fù)制的引物。家蠶濃核病毒Bombyx mori densovirus（BmDNV-1）伊那株是一種昆蟲細(xì)小病毒，屬重復(fù)病毒屬，濃核病毒亞科?；蚪M結(jié)構(gòu)非常簡(jiǎn)單，僅由結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋

3、白兩個(gè)基因組成，是一個(gè)非常理想的研究病毒基因調(diào)控的模式病毒。 本文采用PCR技術(shù)，根據(jù)已知家蠶濃核病毒BmDNV-1（伊那株）的結(jié)構(gòu)蛋白VP4基因設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，并將該基因與原核表達(dá)載體pMAL-c2X分別進(jìn)行雙酶切，然后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B，通過酶切鑒定陽性克隆。經(jīng)序列分析表明，該基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1462 bp，編碼487個(gè)氨基酸殘基，預(yù)計(jì)分子量為54000。 將測(cè)序鑒定正確的陽性克隆命名為pMAL-c2

4、X-VP4，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B感受態(tài)細(xì)胞中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，用抗MBP抗體檢測(cè)目的蛋白，Westen-blotting試驗(yàn)證明所表達(dá)的蛋白是帶有MBP-tag的融合蛋白。通過改變IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間，對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定最佳表達(dá)時(shí)間為3.5h，且當(dāng)IPTG濃度為0.7 mmol/L時(shí)，融合蛋白表達(dá)量接近最大。 利用Amylose親和層析柱純化目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一條帶，純度可達(dá)90％以上。