家蠶濃核病毒BmDNV-3基因組結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、濃核病毒無(wú)囊膜，直徑18～26nm，基因組大小約為4.0～6.5kb。該病毒內(nèi)含有正負(fù)鏈單分子(ssDNA)，或?yàn)檎?，或?yàn)榛パa(bǔ)的負(fù)鏈。濃核病毒具有高度的宿主特異性，并且在通常情況下能引起宿主的死亡。目前濃核病毒最為關(guān)注的是可作為生物殺蟲劑和表達(dá)載體表達(dá)外源蛋白。家蠶作為經(jīng)濟(jì)昆蟲的重要性，自上世紀(jì)80年代人們先后從同本(BuDNV-1、BaDNV-2、BmDNV-5)、中國(guó)鎮(zhèn)江(BaDNV-3)和印度(BeBNV-4)的家蠶中分離到了不

2、同株系DNVs。其中BmDNV-3和BmDNV-2(Yamanashi isolate)都擁有雙分子基因組(VDl，VD2)，并且感染相同的宿主，但在感受性、血清學(xué)上有差異，在宿主感染部位上也存在著不同。本論文中以BeilNV-3作為研究對(duì)象，對(duì)其基因組的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究。主要結(jié)果如下： 1.濃核病毒BmDNV-3基因組中含有兩種沒有同源性的單鏈線形DNA分子(VDl，VD2)，這兩種核酸分子以單鏈(+VDl， -VDl；+V

3、D2， -VD2)線型方式被分開包裝在各自的衣殼蛋白中。該病毒DNAs在高鹽狀態(tài)下被分離、純化。用T4酶(300ngDNA/10U)補(bǔ)平抽提過(guò)程中復(fù)性為雙鏈的病毒DNAs，然后用HindIII進(jìn)行酶切，酶切后的片段克隆到經(jīng)過(guò)HindIII和SmaI平端酶切的pUCll9載體上，完成了對(duì)該病毒的全基因組克隆和序列測(cè)定。序列裝配的結(jié)果顯示：VDl全基因組序列長(zhǎng)為6543個(gè)核苷酸，末端擁有224個(gè)核苷酸術(shù)端反向重復(fù)序列；VD2全基因組序列長(zhǎng)為

4、6022個(gè)核苷酸，末端擁有524個(gè)核苷酸木端反向重復(fù)序列。GenBank序列登錄號(hào)：[DQ017268；DQ017269]。 2.生物信息學(xué)分析顯示：VDl基因組正鏈含有3個(gè)大的開放閱讀框(ORFl～3)，ORFl和ORF2可能編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，因?yàn)樗鼈兒屑?xì)小病毒保守區(qū)域序列NTP-binding和DNA解旋酶結(jié)合域，而ORF3可能編碼結(jié)構(gòu)蛋白，負(fù)鏈含有1個(gè)大的開放閱讀框(ORF4)，由于它與假定的DNA聚合酶有一定的同源性，因

5、此推測(cè)可能編碼非結(jié)構(gòu)蛋白。對(duì)VDl ORF4的1115氨基酸序列與其它病毒DNA聚合酶基因氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)N端含有3個(gè)外切酶的保守區(qū)域與原核和真核生物3'5'外切酶相關(guān)，5個(gè)保守區(qū)域涉及到DNA聚合酶的合成功能，這8個(gè)保守區(qū)域顯示VDl ORF4編碼DNA聚合酶；VD2基因組正鏈含有1個(gè)大的開放閱讀框，負(fù)鏈含有1個(gè)小的開放閱讀框。根據(jù)同源性比較推測(cè)該基因組負(fù)鏈上開放閱讀框(ORF2)可能編碼非結(jié)構(gòu)蛋白，而正鏈上開放閱讀框(ORFl)

6、可能編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白。 3.比較BmDNV-3和BffDNV-2(Yamanashi isolate)基因組全序列，兩者VDl的同源性為98.4％，VD2同源性達(dá)97.7％，并且有228個(gè)堿基的替代、11個(gè)堿基的刪除和2個(gè)堿基插入。比較這兩個(gè)不同株系病毒的開放閱讀框和末端反向重復(fù)序列，突變的熱點(diǎn)集中在結(jié)構(gòu)蛋白(VDl ORF3，VD2 ORFl)，VDl ORF4和未端反向重復(fù)序列上。本研究中的結(jié)論為更好地理解家蠶濃核病毒不同

7、株系差異性及其可能的原因，也為研究家蠶濃核病毒進(jìn)化提供了有益的線索。 4.在對(duì)VDl基因轉(zhuǎn)錄組織結(jié)構(gòu)研究中，Northern雜交顯示VDl的左邊正鏈上有1.1kb非結(jié)構(gòu)蛋白和1.5kb結(jié)構(gòu)蛋白這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，右邊的負(fù)鏈上有一個(gè)3.3kb非結(jié)構(gòu)蛋白轉(zhuǎn)錄本。3'和5'RACE序列測(cè)定結(jié)果顯示1.1kb非結(jié)構(gòu)蛋白開始于nt290，結(jié)束于nt 1437。ORFl和ORF2完全位于其中，因此有可能通過(guò)核糖體掃描機(jī)制在不同的閱讀框上翻譯兩種蛋

8、白NSl和NS2。1.5kb結(jié)構(gòu)蛋白開始于nt 1423，結(jié)束于nt 2931。編碼結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄本(ORF3)和編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的轉(zhuǎn)錄本(ORF4：)在圖距50處擁有10個(gè)核苷酸的3'端的共同序列。該病毒的轉(zhuǎn)錄方式與己報(bào)道的其它濃核病毒存在著較大差異。 5.該病毒感染的家蠶中腸組織經(jīng)勻漿、40％(w/w)CsCl2梯度離心和定量PCR，結(jié)果顯示VDl和VD2兩者的浮力密度接近相等，約為1.29 g/cm3。該病毒的浮力密度比其它

9、濃核病毒明顯小，再次說(shuō)明該濃核病毒的特殊性。從不同梯度等份樣品中VDl、VD2的起始拷貝數(shù)判斷，得出它們可能位于各自不同的病毒衣殼蛋白中。另外，SDS-PAGE電泳分析結(jié)果顯示BmDNV-3病毒的衣殼蛋白的分子量為48kDa、55kDa、72kDa和97kDa的4條明顯條帶，其中53kDa為主要組分。 6.在原核表達(dá)載體中構(gòu)建了pET28a(+)-VDl ORF4 3'端部分，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL2 1中。通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)