家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)基因組片段7(S7)功能的研究.pdf

1、家蠶質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori cypovirus,BmCPV)是家蠶幼蟲的主要病原微生物之一,能感染家蠶中腸細(xì)胞導(dǎo)致家蠶發(fā)生中腸型膿病,引起養(yǎng)蠶歉收。BmCPV基因組由10個(gè)dsRNA節(jié)段組成,S7節(jié)段編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP7。本研究用VP7抗體通過免疫組織化學(xué)、Western blotting檢測(cè)了VP7在細(xì)胞內(nèi)的定位、切割、表達(dá)時(shí)相,探討了抑制 vp7基因表達(dá)對(duì)BmCPV增殖的影響,通過 Co-IP篩選了VP7與宿主細(xì)胞互作

2、候選蛋白,并通過質(zhì)譜對(duì)候選蛋白進(jìn)行了鑒定,研究結(jié)果為深刻理解S7節(jié)段編碼的VP7的功能、BmCPV與宿主的互作提供了新的線索。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、臖mCPV VP7的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備。將vp7基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-28a(+),構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-28a-S7。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株并誘導(dǎo)表達(dá),結(jié)果顯示重組蛋白VP7的分子量約為55 kDa。將重組蛋白VP7免疫成年小鼠,制備VP7抗體。We

3、stern blotting檢測(cè)結(jié)果顯示制備的多抗具有特異性,可用于VP7的檢測(cè)。
　?、艬mCPV VP7的切割分析。為了分析BmCPV VP7是否被切割,將vp7基因克隆進(jìn)pIZT/V5-His載體,構(gòu)建了重組質(zhì)粒pIZT/V5-His-S7,該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞,經(jīng)抗生素Zeocin篩選獲得表達(dá)VP7重組蛋白的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用His6抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的重組蛋白VP7的分子量約

4、為65 kDa,比理論分子量略大。用VP7抗體進(jìn)行Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),除了65 kDa的重組蛋白VP7外,還能檢測(cè)到分子量約為35 kDa的2種蛋白(V35a, V35b),推測(cè)VP7在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中被切割成了分子量較小的蛋白。對(duì)感染 BmCPV6d的BmN細(xì)胞和感染 BmCPV8d的中腸后部組織進(jìn)行Western blotting檢測(cè),結(jié)果顯示,在感染的BmN細(xì)胞和感染的中腸組織中,均可檢測(cè)到分子量約為55 kDa的

5、蛋白條帶,除此之外,在感染的BmN細(xì)胞中也可檢測(cè)到分子量約為20 kDa的蛋白條帶,在感染BmCPV的中腸組織中也可檢測(cè)到25 kDa和20 kDa的蛋白條帶。說明VP7在病毒感染的細(xì)胞中被切割,但在感染的培養(yǎng)細(xì)胞和感染的中腸組織中切割方式存在差異,VP7在感染細(xì)胞與非感染細(xì)胞中的切割方式也存在不同。用VP7抗體對(duì)BmCPV病毒粒子進(jìn)行Western blotting檢測(cè),發(fā)現(xiàn)除可檢測(cè)到55 kDa的特異性條帶外,還能夠檢測(cè)到分子量約3

6、8、25和10 kDa大小的3個(gè)蛋白條帶,推測(cè)BmCPV病毒粒子中存在不同切割程度的VP7。
　　⑶VP7的亞細(xì)胞定位及BmCPV感染過程中VP7蛋白水平的變化分析。對(duì)感染BmCPV8d的中腸后部進(jìn)行組織免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn),綠色熒光集中在細(xì)胞質(zhì)中,表明VP7定位在細(xì)胞質(zhì)。感染BmCPV1d~12d后的中腸后部組織蛋白定量后進(jìn)行Western blotting檢測(cè),在感染7d的組織中,可檢測(cè)到20 kDa左右的蛋白條帶;感染8d時(shí),V

7、P7表達(dá)量增加,可檢測(cè)到55、25和20 kDa蛋白;感染9d時(shí),VP7表達(dá)量達(dá)到高峰,除可檢測(cè)到55 kDa蛋白外,也可檢測(cè)到28、25、20和18 kDa蛋白條帶;10、11和12d VP7的表達(dá)與第9d相似,但多檢測(cè)到1個(gè)分子量約為22 kDa蛋白。推測(cè)VP7在病毒增殖的不同時(shí)期,其切割方式可能存在細(xì)微差異。
　?、纫种苬p7基因表達(dá)對(duì)病毒增殖的影響。為了進(jìn)一步探究 vp7基因表達(dá)對(duì)病毒增殖的影響,3齡起家蠶注射VP7-si

8、RNA(1μg/頭),24h后,人工感染BmCPV,48h后檢測(cè)vp7和vp1的RNA水平,結(jié)果顯示vp7基因和vp1基因的相對(duì)表達(dá)水平分別下降了5.2倍和15.4倍;BmN培養(yǎng)細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染3種VP7-siRNA24h后,人工感染BmCPV,48h后檢測(cè)vp7和vp1的RNA水平,結(jié)果顯示vp7基因相對(duì)表達(dá)量分別下調(diào)17.5、9.7和4.7倍,vp1基因的相對(duì)表達(dá)量分別下調(diào)13.0、6.3和3.0倍,表明抑制 vp7基因表達(dá),可抑制Bm