家蠶核型多角體病毒基因p24的功能研究.pdf

1、P24是一種重要的核衣殼相關蛋白，其基因p24在桿狀病毒生活史中所發(fā)揮的作用以及在細胞中的功能少有人研究，本實驗選取BmNPV為載體對該基因進行深入研究。本實驗首先擴增出含有Bmp24基因同源臂的打靶片段，利用Red重組技術實現了打靶片段與目的基因之間的替換，進而成功構建了Bmp24缺失型病毒并命名為Bmp24-ko-Bacmid;然后構建重組轉移載體pF astBacHTB-p24，利用Bac-to-Bac系統(tǒng)將該Bmp24定點補回到

2、缺失型Bacmid的多角體啟動子下游，成功構建了Bmp24補回型Bacmid并命名為Bmp24-re-Bacmid。
　　為了研究Bmp24在細胞中的調控功能，實驗將缺失型病毒(Bmp24-ko-Bacmid)、補回型病毒(Bmp24-re-Bacmid)以及野生型病毒(wtBacmid)等量轉染到正常的家蠶卵巢細胞(BmN)當中。病毒滴度測定結果顯示3種病毒的轉染都能夠引起細胞發(fā)病，即都可以產生有感染力的子代病毒。通過滴度值得比

3、較，發(fā)現Bmp24缺失型病毒的滴度值顯著低于野生型和補回型病毒（P＜0.05）。為了進一步了解Bmp24對病毒顆粒包裝的影響，收集感染48h后的細胞進行透射電鏡分析，電鏡結果顯示Bmp24缺失型病毒感染的細胞中只有少量細長的桿狀結構，但在野生型病毒感染的細胞當中出現大量包裝成熟的病毒顆粒。透射電鏡顯示缺失Bmp24仍然可以包裝子代病毒，但對包裝為成熟的病毒粒子有顯著影響，與滴度測定結果一致。
　　為了研究Bmp24的缺失對病毒基因

4、組復制的影響，實驗選取了ODV的囊膜蛋白結構基因Bmgp41為代表基因，進行qPCR分析。實驗結果顯示隨著3種病毒基因組轉染時間的延長，Bmgp41的拷貝數均增加，但各時相Bmgp41的拷貝數無顯著差異。為了研究Bmp24的缺失對病毒基因組轉錄水平的影響，實驗選取了BmNPV中非常具有代表性的3個基因進行RT-qPCR，分別是病毒早期基因Bmlef-3、晚期基因Bmvp39和極晚期基因Bmp10。RT-qPCR實驗結果顯示，相對于野生型

5、病毒，Bmp24的缺失會顯著降低子代病毒基因組中Bmlef-3、Bmvp39和Bmp10的轉錄水平（P＜0.05），但Bmp24的補回可以彌補這一現象。綜上所述可知，Bmp24基因的缺失對子代病毒基因組的復制水平沒有顯著影響，即是病毒復制的非必需基因;缺失Bmp24基因的Bacmid仍然可以產生有感染力的BV粒子，說明Bmp24基因不是BV形成的必需基因;但Bmp24的缺失會降低子代病毒的感染力，說明Bmp24對BV的感染力有一定影響。

6、RT-qPCR結果說明Bmp24基因缺失會降低病毒基因組早期、晚期以及極晚期基因的轉錄水平，即Bmp24的缺失對病毒基因轉錄水平有一定影響。
　　為了進一步研究該基因的性質，本實驗將目的基因Bmp24克隆到原核表達載體pET-28a(+)上，在大腸桿菌BL-21(star)中誘導表達帶有6×His標簽的融合蛋白，大小約為24.8KDa，與預期一致。通過Ni柱純化獲得BmP24并進行BCA定量，通過免疫新西蘭雄兔制備多克隆抗體。EL