家蠶核型多角體病毒FGF的細(xì)胞和組織定位研究.pdf

1、成纖維細(xì)胞生長因子(FibroblastGrowthFactors，F(xiàn)GFs)大都發(fā)現(xiàn)于脊椎動物(包括人)，是一種具有廣泛生物活性的蛋白分子。已有研究表明，F(xiàn)GFs對機體發(fā)育、組織的結(jié)構(gòu)與功能的維持、損傷的愈合與修復(fù)都有作用，還與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等多種病理過程有關(guān)。本研究分離純化了柞蠶多角體病毒(Antheraeapernyinuclearpolyhedrinvirus，ApNPV)，并在對該病毒DNA序列分析時，發(fā)現(xiàn)了一個與人源fgf

2、基因相似的基因。該基因存在于所有已公布的桿狀病毒全序列中，但功能未知。為了解該基因在病毒感染中所起的作用，本文在家蠶—桿狀病毒的模型中對fgf基因進行了初步研究，包括對家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclearpolyhedrinvirus，BmNPV)的fgf基因進行了克隆、表達和功能的研究，主要結(jié)論如下： 1.克隆了柞蠶多角體病毒ApNPV中的fgf基因。該基因大小為558bp，其讀碼框含有185aa，是一個新

3、基因。該基因已在GenBank上登錄(登錄號為AY641527)。 2.克隆和表達了家蠶核型多角體病毒中fgf基因。構(gòu)建了原核表達載體pET28a-fgf,通過IPTG誘導(dǎo)表達后，SDS-PAGE顯示在27kDa左右有一特異條帶，與預(yù)測的蛋白質(zhì)分子量大小一致。該蛋白在大腸桿菌中含量較高并以包涵體的形式存在，表達產(chǎn)物含有6個組氨酸殘基，用Ni-NTA親和層析柱高效純化了表達產(chǎn)物。 3.以綠色熒光蛋白(greenfluo

4、rescenceprotein，GFP)作為融合基因，構(gòu)建真核表達載體pCDNA3.1-gfp-fgf。該基因在高等哺乳動物細(xì)胞COS-7細(xì)胞中表達，并定位在細(xì)胞核內(nèi)，可能影響COS-7細(xì)胞中DNA復(fù)制或基因的轉(zhuǎn)錄。 4.桿狀病毒表達系統(tǒng)中，F(xiàn)GF在不同細(xì)胞系中表達定位不盡相同。構(gòu)建重組轉(zhuǎn)座載體Bacmid-gfp-fgfDNA，轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得重組病毒Ac-gfp-fgf,分別感染TN5和Sf9細(xì)胞使FGF在這兩種細(xì)胞中過量表達

5、，發(fā)現(xiàn)該蛋白定位于細(xì)胞膜。構(gòu)建重組轉(zhuǎn)移載體pBacPAK8-gfp-frf與線性化的Bm-pBacPAK6DNA共轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，該蛋白定位于BmN細(xì)胞的細(xì)胞核中。FGF在不同細(xì)胞中定位不同，表明FGF分子與細(xì)胞間存在識別關(guān)系，即來源于親和病毒的FGF才能被該細(xì)胞識別，作用于核內(nèi)。 5.FGF在蠶體各個器官中的表達具有一定的靶向作用。Bm-GFP-FGF重組病毒注射四齡蠶，以Bm-GFP病毒作為對照，對蠶感染后不同時期的主要器