家蠶核型多角體病毒ORF67等基因分析.pdf

1、桿狀病毒是節(jié)肢動(dòng)物，特別是鱗翅目昆蟲重要的病原微生物。到目前為止，已有42種桿狀病毒，包括33種核型多角體病毒和9種顆粒體病毒的基因組全序列被測(cè)定。對(duì)基因組全序列分析發(fā)現(xiàn)，僅有30個(gè)基因在所有已經(jīng)測(cè)序的桿狀病毒中都存在，稱為桿狀病毒的核心基因；而在鱗翅目桿狀病毒中，有62個(gè)基因是保守存在的。 家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV)是桿狀病毒的模式病毒之一；本研究選擇了o

2、rf67、p33兩個(gè)桿狀病毒核心基因和p26、orf122兩個(gè)鱗翅目桿狀病毒保守基因?yàn)檠芯繉?duì)象，從基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、亞細(xì)胞定位、病毒結(jié)構(gòu)定位、基因缺失等方面，研究基因的基本特性及其功能，從而為豐富桿狀病毒分子生物學(xué)提供理論基礎(chǔ)。 本研究主要結(jié)論如下： 1.BmNPV orf67(Bm67)基因分析Bin67位于BmNPV(T3株)基因組61190-61892nt，讀碼框全長(zhǎng)705bp，編碼234個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為2

3、7.0kDa。在Bm67起始密碼子ATG上游57nt處有一桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序ATAAG。用RT-PCR分析了Bm67的轉(zhuǎn)錄時(shí)相，結(jié)果表明，Bm67在6h p.i.開始轉(zhuǎn)錄。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)融合表達(dá)了Bm67蛋白，并用其制備了多克隆抗血清。利用此抗血清進(jìn)行Bm67表達(dá)時(shí)相的Western blot分析，發(fā)現(xiàn)Bin67表達(dá)產(chǎn)物在12h p.i.被檢測(cè)出來。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，Bm67是一個(gè)桿狀病毒晚期表達(dá)基因。免疫熒光定位分析表明，Bm

4、67的表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布。 為了進(jìn)一步研究Bm67在病毒侵染循環(huán)中的作用，利用ET重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了Bm67的缺失病毒，進(jìn)而利用Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)在多角體位點(diǎn)重新補(bǔ)回Bm67的補(bǔ)回病毒。研究發(fā)現(xiàn)，Bm67缺失病毒不能生成有感染力的病毒粒子，而補(bǔ)回病毒能夠彌補(bǔ)這一缺陷，BV的滴度能夠達(dá)到野生病毒的水平．定量PCR分析表明，Bm67是侵染早期合成正常數(shù)量的病毒DNA所必需的。透射電鏡分析表明，Bm67

5、的缺失降低了病毒核衣殼的裝配，影響了囊膜的形成，在雙層核膜中間發(fā)現(xiàn)了囊膜裝配錯(cuò)誤的核衣殼。這些結(jié)果表明Bm67是形成有感染力的BV所必需的，且與核衣殼的裝配及囊膜的的形成等過程有關(guān)。 2.BmNPV p33(p33)基因分析P33位于BmNPV(T3株)基因組70487-71264nt，讀碼框全長(zhǎng)780bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)259個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)分子量為30.9kDa。在p33起始密碼子ATG上游184-181nt，153-1

6、50nt和125-122nt處有三個(gè)桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序TAAG。RT-PCR分析表明，p33在12h p.i.開始轉(zhuǎn)錄．利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了GST-p33融合蛋白并利用該蛋白制備了多克隆抗血清．利用此抗血清進(jìn)行p33的表達(dá)時(shí)相分析發(fā)現(xiàn)，p33的表達(dá)產(chǎn)物在18h p.i.被檢測(cè)出來。以上試驗(yàn)結(jié)果表明，p33是一個(gè)桿狀病毒晚期表達(dá)基因。利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)成功將p33與egfp在BmN細(xì)胞中進(jìn)行了融合表達(dá)；結(jié)果表明，p3

7、3沒有較大的翻譯后修飾，在48h p.i.，EGFP-p33主要定位在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并呈指環(huán)形點(diǎn)團(tuán)狀分布；免疫熒光定位進(jìn)一步驗(yàn)證了上述試驗(yàn)結(jié)果．利用抗p33的特異性抗體，對(duì)提取純化的BVs和ODVs進(jìn)行了western blot分析，但均沒有檢測(cè)到特異性的條帶，表明p33不是病毒的結(jié)構(gòu)蛋白． 3.BmNPVp26(p26)基因分析P26位于BmNPV(T3株)基因組107702-108422nt，讀碼框全長(zhǎng)723bp，編碼一個(gè)長(zhǎng)24

8、0個(gè)氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測(cè)分子量為27.3kDa。在p26起始密碼子ATG上游21.24nt處有1個(gè)TATA box。P26 mRNAs在3h p.i.就可以檢測(cè)到，一直持續(xù)到96h p.i.。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了融合蛋白His-p26，利用其制備了多克隆抗體。利用此抗體對(duì)p26的表達(dá)時(shí)相進(jìn)行了分析，在18h p.i.才可以檢測(cè)到p26的表達(dá)，這可能與在病毒侵染早期p26的表達(dá)量較低有關(guān)。利用Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)將p26與

9、egfp在BmN細(xì)胞中進(jìn)行了融合表達(dá)，結(jié)果顯示p26在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中都有分布，且在細(xì)胞核中聚集成團(tuán)狀；免疫熒光定位表明p26主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，這可能是因?yàn)槿诤媳磉_(dá)時(shí)p26為過量表達(dá)有關(guān)。 4.BmNPV orf122(Bm122)基因分析Bm122位于BmNPV(T3株)基因組116325～116928nt，讀碼框全長(zhǎng)606bp，編碼201個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量約為22.9kDa。在Bm122起始密碼子ATG上游240和189