斜紋夜蛾核型多角體病毒ⅡORF56基因的特性分析.pdf

1、斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ(Spodoptera litura multicapsidNucleopolyhedrovirusⅡ,SpltMNPVⅡ)是一種繁殖率和毒力極強(qiáng)的新型昆蟲(chóng)桿狀病毒,其基因組全序列已測(cè)定,在其編碼的149個(gè)ORFs中,一些基因的功能已被闡明,但還有許多基因的功能尚不清楚。ORF56是其中一個(gè)功能未知的重要基因,本研究以SpltMNPVⅡORF56為研究對(duì)象,在對(duì)其進(jìn)行序列分析、克隆表達(dá)及多抗制備的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步從

2、基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)、結(jié)構(gòu)定位、基因缺失等方面,研究該基因的基本特性及其功能,旨在豐富桿狀病毒的分子生物學(xué)信息。論文主要成果如下:
　　 1、利用生物信息學(xué)軟件對(duì)SpltMNPVⅡ ORF56基因進(jìn)行了序列分析。ORF56基因位于基因組54166～54840 bp,全長(zhǎng)675 bp,編碼一個(gè)含224個(gè)氨基酸殘基的蛋白,預(yù)測(cè)分子量約為25.9 kD。序列分析顯示,在ORF56基因ATG上游存在桿狀病毒晚期轉(zhuǎn)錄基序GTAAG,在終止密碼

3、子TAA下游發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)AATAAA；推導(dǎo)的氨基酸序列中含有13個(gè)磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)、1個(gè)Bromodomain結(jié)構(gòu)域和1個(gè)TFS2N基序。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn),ORF56是一個(gè)保守性很強(qiáng)的蛋白,在47種桿狀病毒基因組里都能找到其同源基因。
　　 2、利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了ORF56融合蛋白并制備了多克隆抗體。首先根據(jù)ORF56基因序列設(shè)計(jì)引物,以SpltMNPVⅡ基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,將得到的基因克隆至

4、原核表達(dá)載體pET32a(+),在原核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了基因的融合表達(dá)。用割膠回收純化的蛋白疫新西蘭大白兔,制備了ORF56蛋白的多克隆抗體。
　　 3、RT-PCR定性分析和Real-time PCR定量分析結(jié)果均表明,ORF56基因從病毒感染后12 h開(kāi)始轉(zhuǎn)錄,一直持續(xù)到72 h,可能是一個(gè)晚期基因。利用自制的抗體進(jìn)行表達(dá)時(shí)相分析發(fā)現(xiàn),ORF56的表達(dá)產(chǎn)物在病毒感染宿主細(xì)胞后24 h被檢測(cè)出來(lái),一直持續(xù)72 h都有表達(dá),大小約為2

5、6.0 kD,與預(yù)測(cè)的大小一致,推測(cè)ORF56是一個(gè)晚期表達(dá)基因,并且沒(méi)有發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)錄后修飾。利用Western blot方法檢測(cè)分離出的BV、ODV粒子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORF56在兩種病毒粒子都能檢測(cè)到。
　　 4、構(gòu)建了以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)基因?yàn)闃?biāo)記的、ORF56缺失的重組斜紋夜蛾核型多角體病毒。分別擴(kuò)增出ORF56讀碼框上下游的不同片段及多角體啟動(dòng)子啟動(dòng)的egfp,將三個(gè)片段按順序克隆進(jìn)pUC19載體,構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載

6、體pAORF56-egfp。將p△ORF56-egfp與野生型SpltMNPVⅡ DNA共轉(zhuǎn)染Spli細(xì)胞,通過(guò)同源重組和空斑篩選的方法,獲得了以egfp基因替代ORF56的缺失重組病毒SpltMNPVⅡ-△ORF56-egfp,并在細(xì)胞水平上進(jìn)行了對(duì)ORF56基因的功能進(jìn)行了初步分析。用SpltMNPVⅡ-△ORF56-egfp感染Spli細(xì)胞后的復(fù)制結(jié)果顯示,ORF56的敲除并不影響病毒在細(xì)胞水平上的增殖和復(fù)制,說(shuō)明ORF56可能是