斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型(SpltMNPVⅡ)BV、ODV組成型蛋白質(zhì)譜分析和4種ORF的基因分析.pdf

1、斜紋夜蛾(Spodoptera litura，Spli)屬鱗翅目夜蛾科，是一種雜食性農(nóng)業(yè)和林業(yè)害蟲，主要危害甘藍(lán)、白菜、藕、芋、蕹菜、莧菜、馬鈴薯、茄子、辣椒、番茄、豆類、瓜類以及蔥韭等。由于斜紋夜蛾的食性雜、世代重疊、抗性強(qiáng)，因此防治難度高。在各種化學(xué)合成殺蟲劑嚴(yán)重污染環(huán)境，害蟲對(duì)化學(xué)合成殺蟲劑抗性日益增強(qiáng)的情況下，生物防治越顯重要和迫切。從自然界中尋找和篩選新的高毒力的病毒株系是開(kāi)發(fā)NPV 生物殺蟲劑的重要途徑。SpltMNPVⅡ是

2、一種繁殖率和毒力極強(qiáng)的新的病毒變異株。該病毒株的基因組全序列已經(jīng)測(cè)定完成。但病毒BV和ODV的組成蛋白并不清楚，論文對(duì)SpltMNPVⅡBV和ODV 進(jìn)行了質(zhì)譜分析，確定了BV和ODV蛋白組成，并對(duì)組成蛋白基因的中的ORF6、ORF13、ORF57和ORF146 進(jìn)行了啟動(dòng)子活性分析，轉(zhuǎn)錄時(shí)相和表達(dá)時(shí)相分析，對(duì)ORF57基因的部分功能進(jìn)行了鑒定。主要研究結(jié)果與發(fā)現(xiàn)：
　　 1.用二級(jí)質(zhì)譜分析方法對(duì)SpltMNPVⅡ BV和ODV

3、的組成蛋白進(jìn)行了研究，確定了SpltMNPVⅡ BV 由42種蛋白組成，通過(guò)與已知桿狀病毒同源基因的比較，確定了其中26種蛋白基因的部分功能；SpltMNPVⅡ ODV 由46種蛋白組成，與已知桿狀病毒同源基因的比較，確定了其中24種蛋白基因的部分功能。
　　 2.對(duì)SpltMNPVⅡORF6、ORF13、ORF57和ORF146基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。ORF6基因全長(zhǎng)1509 bp，編碼502 aa，預(yù)測(cè)蛋白分子量為55.0 kD

4、a。該基因既有早期啟動(dòng)子基序CAGT，又有晚期啟動(dòng)子基序ATAAG，推測(cè)該基因可能是一個(gè)在病毒生命周期中早晚期都表達(dá)的基因；ORF13基因讀碼框全長(zhǎng)333 bp，編碼110 aa，理論預(yù)測(cè)蛋白分子量為12.2 kDa。起始密碼子ATG上游發(fā)現(xiàn)有一個(gè)TATA box和桿狀病毒晚期啟動(dòng)子基序ATAAG，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的早期啟動(dòng)子基序；ORF57基因全長(zhǎng)1098 bp，編碼365 aa，預(yù)測(cè)蛋白分子量為42.6 kDa。起始密碼子ATG上游發(fā)現(xiàn)

5、有一個(gè)TATA box，在起始密碼子上游沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的早期和晚期啟動(dòng)子基序；ORF146基因涵蓋了1383 bp的讀碼框，編碼460 aa，理論預(yù)測(cè)蛋白分子量為50.2kDa。該基因起始密碼子ATG上游發(fā)現(xiàn)有一個(gè)TATA box，一個(gè)晚期啟動(dòng)子基序ATAAG。
　　 3.對(duì)SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13、ORF57和ORF146基因的啟動(dòng)子活性和轉(zhuǎn)錄時(shí)相進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)這4個(gè)基因是在病毒生命周期的早期和晚期都有轉(zhuǎn)錄的基

6、因。其中ORF13和ORF146基因能被SpltMNPVⅡ病毒編碼的反式作用因子所激活，在感染后期能提高轉(zhuǎn)錄水平。而ORF6基因也能被SpltMNPVⅡ病毒編碼的反式作用因子所激活，但是為負(fù)調(diào)控，在感染后期轉(zhuǎn)錄水平有明顯下降。
　　 4.對(duì)SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13和ORF146基因的部分序列進(jìn)行了原核表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化和質(zhì)譜鑒定后，免疫豚鼠制作了多克隆抗體?？贵w效價(jià)用ELISA進(jìn)行測(cè)定,3個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物制作的

7、抗體效價(jià)都在1：2500以上。
　　 5.以制備的多克隆抗體為一抗，對(duì)SpltMNPVⅡ ORF6、ORF13和ORF146基因在宿主細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了表達(dá)時(shí)相分析。0RF6基因產(chǎn)物最早在病毒感染細(xì)胞后8 h 出現(xiàn)，0RF146基因產(chǎn)物最早在病毒感染細(xì)胞后4 h 出現(xiàn)，并且后期都有表達(dá)，說(shuō)明這兩個(gè)基因都是早期和晚期均表達(dá)的基因，與它們的啟動(dòng)子分析和轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析結(jié)果一致。而ORF13 最早在出現(xiàn)病毒感染細(xì)胞后12 h，并一直持續(xù)

8、到后期，說(shuō)明ORF13 為晚期表達(dá)基因。但是ORF13的啟動(dòng)子活性分析和轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析都表明該基因是個(gè)早晚期都表達(dá)的基因?？赡苁怯捎谠摶蛟诒磉_(dá)的初始階段，蛋白合成量和積累水平比較低，還不足以檢測(cè)出來(lái)的緣故。
　　 6.克隆和表達(dá)了SpltMNPVⅡ ORF57基因的完整ORF，純化的表達(dá)產(chǎn)物用質(zhì)譜進(jìn)行了鑒定。采用同位素法和痕量磷特異檢測(cè)方法（孔雀石綠檢測(cè)試劑法）確定了ORF57基因是一個(gè)雙功能酶基因，該基因編碼的蛋白既具有多聚核