棉鈴蟲核型多角體病毒ORF115a和ORF127基因的克隆及表達(dá).pdf

1、棉鈴蟲是一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，危害多種農(nóng)作物，給棉花生產(chǎn)帶來巨大損失，而且對多種化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性。棉鈴蟲單粒包埋型核多角體病毒(HelicoverpaarmigerasingleNPV，HaSNPV)是專性侵染棉鈴蟲桿狀病毒。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有許多基因的功能被了解清楚，例如HaSNPVORF128基因，HaSNPVORF135基因等，但是，還有許多基因的功能是未知的，例如：HaSNPVORF115a基因和HaSNPVORF

2、127基因。在本研究中，作者對HaSNPVORF115a和HaSNPVORF127基因進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，克隆了這兩個基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)，為下一步功能的分析打下基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)論如下： 1、HaSNPVORF115a基因的初步研究結(jié)果 HaSNPVORF115a位于HaSNPVC1菌株基因組中109，493bp和110，419bp之間，編碼區(qū)有926bp，編碼一個308氨基酸的多肽，分析表明：其分子量為

3、37.135KDa，等電點(diǎn)為5.14。利用ExPASyserver對HaSNPV115a基因推測的蛋白序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所推測氨基酸序列中不存在信號肽序列、轉(zhuǎn)膜區(qū)、核定位區(qū)和膜滯留區(qū)，但在838-851核苷酸處發(fā)現(xiàn)一些重要的基序，這些基序包括：1個Thiolasesactive位點(diǎn)、1個Thiolasesacyl-enzymeintermediatesignature和1個Thiolasessignature。通過對HaSNPVO

4、RF115a的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)HaSNPVORF115a與美洲棉鈴蟲核型多角體病毒同源關(guān)系最近。 根據(jù)已發(fā)表的GenBank中已登錄的HaSNPVC1株基因組的核苷酸序列(GenBank登錄號為AF303045)設(shè)計并合成引物，以HaSNPVC1株基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增到HaSNPVORF115a基因，并將其連接至pMD18-TEasy載體上，并利用設(shè)計的酶切位點(diǎn)將目的基因從T載體上切下。在T4DNALigase酶連接作用

5、下，將ORF115a目的基因與pGEX-4T-2載體連接。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化并用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-4T-2-ORF115a；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE電泳，與對照相比在63KDa左右出現(xiàn)一條特異性高濃度條帶，pGEX/Ha115經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生的與預(yù)期分子量的大小相符。經(jīng)Westernblotting分析進(jìn)一步證實，63KDa的特異性條帶與抗GST抗體發(fā)生很強(qiáng)的印跡反應(yīng)。這說明pGEX/Ha

6、115a經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生的63KDa的特異性條帶是Ha115a與GST融合的蛋白。 2、HaSNPVORF127基因的初步研究結(jié)果 通過對HaSNPVORF127基因核苷酸序列進(jìn)行了生物學(xué)信息分析，HaSNPVORF127位于HaSNPVC1菌株基因組的119，723bp和120，301bp之間，編碼框有578個核苷酸，編碼192個氨基酸殘基，利用http：//www.expasy.ch/tools/網(wǎng)站對HaSNP

7、VORF127基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其分子量為22.567KDa，等電點(diǎn)為9.82。通過對HaSNPVORF127的進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)HaSNPVORF127與HzSNPVORF131同源關(guān)系最近。 根據(jù)已發(fā)表的GenBank中已登錄的HaSNPVC1株基因組的核苷酸序列，(GenBank登錄號為AF303045)設(shè)計并合成引物，設(shè)計引物，以HaSNPVC1株基因組為模板，利用PCR技術(shù)擴(kuò)增到HaSNPVORF127基因，

8、并將其克隆至pMD18-TEasy載體上。并利用設(shè)計的酶切位點(diǎn)將目的基因從T載體上切下。在T4連接酶連接作用下，將ORF127目的片段與pGEX-4T-2載體連接。連接產(chǎn)物經(jīng)轉(zhuǎn)化并用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，得到表達(dá)載體質(zhì)粒pGEX-4T-2-0RF127；經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE電泳，與對照相比在48KDa左右出現(xiàn)一條特異性高濃度條帶，經(jīng)Westernblotting分析，pGEX/Ha127經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后產(chǎn)生的48K