斜紋夜蛾核型多角體病毒ⅡORF59基因的分析.pdf

1、桿狀病毒(Baculovirus)是節(jié)肢動物,特別是鱗翅目昆蟲重要的病原微生物,在重要農(nóng)林害蟲的生物防治中具有廣闊的應用前景,具有化學殺蟲劑無法比擬的優(yōu)點。桿狀病毒的分子生物學研究已取得了很大進展。開發(fā)出的桿狀病毒表達載體系統(tǒng)、重組桿狀病毒殺蟲劑、桿狀病毒作為基因治療的載體、重組桿狀病毒表面展示系統(tǒng)為科學研究和實際運用作出了巨大貢獻。斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ(SpltMNPVⅡ),是2004年由Kamiya等在日本分離得到的一種新發(fā)現(xiàn)的

2、繁殖率和毒力極強的病毒株。其宿主斜紋夜蛾(Spodoptera litura,Spli)是鱗翅目夜蛾科的雜食性害蟲,分布范圍廣,是我國糧棉、油等經(jīng)濟作物和蔬菜的重要害蟲之一。應用SpltMNPVⅡ防治斜紋夜蛾是一種有效的生物防治方法,而通過基因工程手段構建新的高效殺蟲病毒是改良生物病毒殺蟲劑的重要途徑。SpltMNPVⅡ全基因組序列已經(jīng)測定,共149個ORFs。其中一些基因的功能已闡明,但還有許多基因的功能尚不清楚。在SpltMNPVⅡ

3、和其它已報道的桿狀病毒的同源基因中,ORF59尚沒有研究報道過,且質(zhì)譜分析表明該基因位于ODV中。本研究對ORF59基因進行了結(jié)構與生物學特性的初步研究,主要工作及成果如下:
　　 ⑴克隆了SpltMNPVⅡORF59基因,該基因編碼區(qū)含645bp,編碼分子量為25.4kD的多肽(GenBank登錄號:NC_011616)。分析了該基因的核苷酸和氨基酸序列特征,并進行了ORF59蛋白的二級結(jié)構預測,初步推測該基因可能與基因表達調(diào)

4、控以及病毒粒子的轉(zhuǎn)運有關。
　　 ⑵表達并制備了ORF59蛋白的兔多克隆抗體。將orf59基因克隆至原核表達載體pET28a(+),經(jīng)IPTG誘導,SDS-PAGE顯示該蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中獲得了表達,并且誘導4小時表達量最高,同時進行了western blot鑒定。orf59基因在大腸桿菌中原核表達后,純化融合的目的蛋白,并肌肉注射,免疫新西蘭大白兔制備兔多抗。免疫雙擴散測定抗體效價,結(jié)果表明制備的多抗效價良好,

5、可以作為后續(xù)實驗所用。
　　 ⑶對orf59基因的轉(zhuǎn)錄時相及其基因產(chǎn)物的定位進行了分析。收集感染SpltMNPVⅡ不同時間點的Spli細胞,提取總RNA后用orf59特異性引物進行RT-PCR和Realtime-PCR,分析其轉(zhuǎn)錄規(guī)律。結(jié)果顯示,在早期和晚期二者均能檢測到轉(zhuǎn)錄本,從病毒感染后3h就開始轉(zhuǎn)錄,一直持續(xù)到72h,這與序列分析顯示該基因是早晚期基因的結(jié)果一致。分離純化病毒粒子BV和ODV后,利用制備的兔多克隆抗體檢測O

6、RF59蛋白的表達情況,western blot結(jié)果顯示該基因定位于ODV中,與質(zhì)譜分析結(jié)果一致。
　　 ⑷構建了以增強型綠色熒光蛋白基因(egfp)為標記的、orf59失活的重組斜紋夜蛾核型多角體病毒。分別擴增出orf59讀碼框上下游的不同片段及pph啟動子啟動的egfp,將三個片段按順序克隆進pUC19載體,構建了轉(zhuǎn)移載體p△orf59-egfp。將p△orf59-egfp與野生型SpltMNPVⅡDNA共轉(zhuǎn)染Spli細胞,