家蠶核型多角體病毒Bm111基因分析.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是家蠶的主要病原微生物。BmNPV為雙鏈DNA病毒，其基因組于1999年已完成測(cè)序，共有143個(gè)開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。近幾年對(duì)BmNPV基因的研究較多，但仍有一些基因功能未知。對(duì)這些未知功能的基因的研究，不僅能夠加深了解桿狀病毒侵染宿主的機(jī)制，也為進(jìn)一步改造桿狀病毒應(yīng)用于生物殺蟲劑和表達(dá)系統(tǒng)的研究奠定基

2、礎(chǔ)。
　　本論文以Bm111基因?yàn)檠芯繉?duì)象，從生物信息學(xué)、基因的轉(zhuǎn)錄、原核表達(dá)、真核表達(dá)以及基因缺失等方面初步研究m111基因的基本特性，獲得主要結(jié)果如下:
　　1.Bm111基因位于BmNPV基因組105577nt～105789nt之間，編碼70個(gè)氨基酸，預(yù)計(jì)分子量為7.9 kD，等電點(diǎn)為5.34。在Bm111基因的起始密碼子上游24bp處，發(fā)現(xiàn)TATA序列，預(yù)測(cè)Bm111為早期基因。對(duì)Bm111編碼的蛋白序列分析，發(fā)現(xiàn)B

3、m111蛋白沒有信號(hào)肽特征，也沒有跨膜結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列同源性比較發(fā)現(xiàn)，在其它鱗翅目核型多角體病毒基因組中不存在Bm111的同源基因，表明Bm111基因在BmNPV的基因組中具有一定的特異性。
　　2.利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了Bm111基因在大腸桿菌BL21內(nèi)的融合表達(dá)。帶有His標(biāo)簽的Bm111融合蛋白大小約為13.8KDa。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot，進(jìn)一步驗(yàn)證Bm111在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)。通過RT-PCR分

4、析發(fā)現(xiàn)，在BmNPV感染宿主細(xì)胞3h后，就可以檢測(cè)到Bm111基因的轉(zhuǎn)錄本，實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bm111為早期基因。
　　3.根據(jù)Red重組系統(tǒng)，在Red重組酶的作用下，將Cm抗性基因與Bm111基因進(jìn)行同源重組，并通過轉(zhuǎn)座的方式獲得帶有g(shù)fp和polh基因的三種重組病毒:Bm111野生型、Bm111缺失型以及Bm111補(bǔ)回型病毒。分別利用這三種重組病毒轉(zhuǎn)染BmN細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bm111基因缺失后能夠