家蠶核型多角體病毒與家蠶抗病毒相關(guān)的蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、家蠶核型多角體病毒是引起家蠶病毒嚴(yán)重感染的關(guān)鍵病原之一，病毒與宿主的相互博弈一直是研究者們關(guān)注的問題。本論文主要從蛋白質(zhì)組水平研究桿狀病毒的ODV病毒粒子結(jié)構(gòu)組分。通過構(gòu)建近等基因系研究宿主對(duì)抗病毒感染的相關(guān)蛋白，希望篩選出一些與家蠶抗性或者感性相關(guān)的節(jié)點(diǎn)蛋白。同時(shí)也從DNA水平篩選抗性相關(guān)的分子標(biāo)記。此外，論文中對(duì)構(gòu)建的近等基因系從不同角度進(jìn)行了評(píng)估，對(duì)利用家蠶EST數(shù)據(jù)庫鑒定質(zhì)譜結(jié)果也進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下： 通過蔗糖密度

2、梯度離心得到了家蠶核型多角體的ODV病毒粒子，并首次使用SDS—PAGE，二維電泳和質(zhì)譜技術(shù)鑒定了ODV病毒粒子或與之相關(guān)的蛋白。鑒定了可靠的19種蛋白，包括15種BmNPV編碼的病毒粒子主要蛋白，分別是Polyhedrin，P78/83，BmOrf40，BmOrf54，GP41/P40，P95，VP39，P25，ODV—EC43，BmOrf94，BmOrf109，P74，P49，ODV—E56和PTP，和4種家蠶蛋白，熱休克同源蛋白，

3、Hsp21.4，谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶，肽基脯氨酰異構(gòu)酶。其中2種BmNPV的蛋白BmOrf40和PTP，為首次鑒定為ODV組成。并且我們提出一種假說，本研究鑒定的家蠶宿主來源的蛋白可能對(duì)ODV核衣殼包裝和成熟有著重要的作用。 在抗核型多角體病毒(NPV)病的家蠶品種NB和高敏感品種306及其近等基因系BC9中，采用500個(gè)RAPD隨機(jī)引物分別在各個(gè)品系的DNA混合物進(jìn)行擴(kuò)增以篩選分子標(biāo)記，獲得了與家蠶抗NPV病有關(guān)的分子標(biāo)記三個(gè)OP

4、F—072023，OPJ—131300，OPM—161200。其中OPF—072023標(biāo)記通過回交代檢測(cè)，證明獲得的標(biāo)記真實(shí)、可靠，并對(duì)該分子標(biāo)記的片段進(jìn)行了克隆、測(cè)序。通過對(duì)該片段的生物信息學(xué)分析，推測(cè)在此分子標(biāo)記處可能有DNA片段的插入，還在家蠶Z染色體上發(fā)現(xiàn)了一個(gè)逆轉(zhuǎn)位子的編碼序列。另外還介紹了一種PCR單一產(chǎn)物直接染色判斷有或無的定性檢測(cè)方法。 為了利于研究NB品系家蠶這種突出的抗病毒特性相關(guān)的蛋白，我們對(duì)高抗，高敏感及

5、近等基因系家蠶五齡起蠶中腸、血淋巴和脂肪體組織的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行了二維電泳分析，并利用質(zhì)譜對(duì)差異蛋白進(jìn)行鑒定。對(duì)3個(gè)家蠶品系的差異蛋白表達(dá)進(jìn)行了比較。在中腸中鑒定了5個(gè)差異蛋白，其中1和2在抗性品系NB和BC9表達(dá)量高于306，而3，4，5號(hào)這3種蛋白在306中表達(dá)較高，這些蛋白可能與家蠶中腸對(duì)BmNPV的抗性或感性有關(guān)。在血淋巴中，有兩種差異表達(dá)的蛋白，分別是β—N已酰氨基葡糖苷酶2和氨基?；?，我們推測(cè)在抗性家蠶的血淋巴中過量表達(dá)的β

6、—N—乙酰氨基葡萄糖苷酶可能會(huì)干擾細(xì)胞膜上的GP64蛋白的N連接聚糖，從而阻止了啟動(dòng)二次感染的一個(gè)關(guān)鍵蛋白的功能，進(jìn)而減少了產(chǎn)生有感染力病毒粒子。在脂肪體組織中鑒定了4種蛋白，其中2種可能與能量代謝有關(guān)，其中1號(hào)蛋白與磷酸甘油激酶(PGK)在序列上高度相似，2號(hào)蛋白是家蠶精氨酸激酶(AK)。第4號(hào)蛋白可能和整合酶的功能相似，第3號(hào)蛋白未能鑒定。 為了從分子水平上評(píng)估我們構(gòu)建的近等基因系的可靠性，尤其是對(duì)其與感性的輪回親本之間遺傳

7、背景的相似性進(jìn)行了評(píng)估。在本研究中，我們對(duì)隨機(jī)多態(tài)性DNA和雙向電泳的一些結(jié)果進(jìn)行了分析，證明其相似性雖比理論的要低，但這個(gè)模型方法對(duì)研究抗性仍然是有價(jià)值的，對(duì)研究家蠶其它的差異基因也是有借鑒作用的。 我們還利用收集的家蠶EST數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換格式后形成MASCOT軟件識(shí)別的數(shù)據(jù)庫，每個(gè)EST經(jīng)6種閱讀框翻譯，然后通過MASCOT軟件對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。還舉例說明這種方法能鑒定那些在目前的蛋白序列數(shù)據(jù)庫中沒有的多肽。這對(duì)一些蛋白數(shù)據(jù)小