家蠶核型多角體病毒與家蠶抗病毒相關的蛋白質組分析.pdf

1、家蠶核型多角體病毒是引起家蠶病毒嚴重感染的關鍵病原之一，病毒與宿主的相互博弈一直是研究者們關注的問題。本論文主要從蛋白質組水平研究桿狀病毒的ODV病毒粒子結構組分。通過構建近等基因系研究宿主對抗病毒感染的相關蛋白，希望篩選出一些與家蠶抗性或者感性相關的節(jié)點蛋白。同時也從DNA水平篩選抗性相關的分子標記。此外，論文中對構建的近等基因系從不同角度進行了評估，對利用家蠶EST數據庫鑒定質譜結果也進行了分析。主要結果如下： 通過蔗糖密度

2、梯度離心得到了家蠶核型多角體的ODV病毒粒子，并首次使用SDS—PAGE，二維電泳和質譜技術鑒定了ODV病毒粒子或與之相關的蛋白。鑒定了可靠的19種蛋白，包括15種BmNPV編碼的病毒粒子主要蛋白，分別是Polyhedrin，P78/83，BmOrf40，BmOrf54，GP41/P40，P95，VP39，P25，ODV—EC43，BmOrf94，BmOrf109，P74，P49，ODV—E56和PTP，和4種家蠶蛋白，熱休克同源蛋白，

3、Hsp21.4，谷胱甘肽硫轉移酶，肽基脯氨酰異構酶。其中2種BmNPV的蛋白BmOrf40和PTP，為首次鑒定為ODV組成。并且我們提出一種假說，本研究鑒定的家蠶宿主來源的蛋白可能對ODV核衣殼包裝和成熟有著重要的作用。 在抗核型多角體病毒(NPV)病的家蠶品種NB和高敏感品種306及其近等基因系BC9中，采用500個RAPD隨機引物分別在各個品系的DNA混合物進行擴增以篩選分子標記，獲得了與家蠶抗NPV病有關的分子標記三個OP

4、F—072023，OPJ—131300，OPM—161200。其中OPF—072023標記通過回交代檢測，證明獲得的標記真實、可靠，并對該分子標記的片段進行了克隆、測序。通過對該片段的生物信息學分析，推測在此分子標記處可能有DNA片段的插入，還在家蠶Z染色體上發(fā)現了一個逆轉位子的編碼序列。另外還介紹了一種PCR單一產物直接染色判斷有或無的定性檢測方法。 為了利于研究NB品系家蠶這種突出的抗病毒特性相關的蛋白，我們對高抗，高敏感及

5、近等基因系家蠶五齡起蠶中腸、血淋巴和脂肪體組織的蛋白質表達進行了二維電泳分析，并利用質譜對差異蛋白進行鑒定。對3個家蠶品系的差異蛋白表達進行了比較。在中腸中鑒定了5個差異蛋白，其中1和2在抗性品系NB和BC9表達量高于306，而3，4，5號這3種蛋白在306中表達較高，這些蛋白可能與家蠶中腸對BmNPV的抗性或感性有關。在血淋巴中，有兩種差異表達的蛋白，分別是β—N已酰氨基葡糖苷酶2和氨基酰化酶，我們推測在抗性家蠶的血淋巴中過量表達的β

6、—N—乙酰氨基葡萄糖苷酶可能會干擾細胞膜上的GP64蛋白的N連接聚糖，從而阻止了啟動二次感染的一個關鍵蛋白的功能，進而減少了產生有感染力病毒粒子。在脂肪體組織中鑒定了4種蛋白，其中2種可能與能量代謝有關，其中1號蛋白與磷酸甘油激酶(PGK)在序列上高度相似，2號蛋白是家蠶精氨酸激酶(AK)。第4號蛋白可能和整合酶的功能相似，第3號蛋白未能鑒定。 為了從分子水平上評估我們構建的近等基因系的可靠性，尤其是對其與感性的輪回親本之間遺傳

7、背景的相似性進行了評估。在本研究中，我們對隨機多態(tài)性DNA和雙向電泳的一些結果進行了分析，證明其相似性雖比理論的要低，但這個模型方法對研究抗性仍然是有價值的，對研究家蠶其它的差異基因也是有借鑒作用的。 我們還利用收集的家蠶EST數據經轉換格式后形成MASCOT軟件識別的數據庫，每個EST經6種閱讀框翻譯，然后通過MASCOT軟件對質譜數據進行分析。還舉例說明這種方法能鑒定那些在目前的蛋白序列數據庫中沒有的多肽。這對一些蛋白數據小