五齡家蠶前胸腺蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、前胸腺是家蠶合成、分泌蛻皮激素的器官,是生長發(fā)育中重要的內(nèi)分泌腺體之一,其分泌的蛻皮激素與咽側(cè)體分泌的保幼激素對家蠶的生長發(fā)育、變態(tài)起著重要的調(diào)控作用,而前胸腺自身合成、分泌蛻皮激素的活性又受到腦特異性的神經(jīng)分泌細(xì)胞分泌的激素如PTTH、PTSP調(diào)控。所以家蠶前胸腺在激素對生長發(fā)育的調(diào)節(jié)、激素合成與分泌的調(diào)控中是很好的研究材料。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是在蛋白質(zhì)的水平大規(guī)模研究基因表達(dá)的產(chǎn)物,研究蛋白質(zhì)的表達(dá)水平和相關(guān)蛋白的活性狀態(tài)。

2、家蠶的前胸腺在生長發(fā)育過程中無論是在形態(tài)上還是在功能上都發(fā)生了顯著的變化。盡管前胸腺及蛻皮激素的研究已有多年,但是從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度研究前胸腺卻仍顯空白,因此我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法首次從整體水平研究了家蠶5齡期前胸腺組織的蛋白質(zhì)構(gòu)成,從分子水平揭示家蠶前胸腺在5齡期生長發(fā)育中的變化。
　　 本研究采用固相化pH梯度(immobilized pH gradient IPG)雙向電泳分離技術(shù)和生物質(zhì)譜分析等鑒定技術(shù),結(jié)合蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)

3、庫檢索系統(tǒng),進(jìn)行家蠶5齡期前胸腺組織的蛋白質(zhì)組成變化研究:建立了家蠶品種p50前胸腺5齡期第1、3、5、9天的雙向電泳圖譜,比較了不同時(shí)間的蛋白組成差異;并比較了p50和秋豐兩品種之間的蛋白組成差異;5齡初期添食MH對p50前胸腺蛋白質(zhì)組成影響;5齡中期添食JH后p50前胸腺蛋白質(zhì)組成的變化;采用MALDI-TOF-MS技術(shù)對主要特異點(diǎn)進(jìn)行了鑒定,進(jìn)一步闡明有關(guān)蛋白質(zhì)的功能。
　　 采用24cm,pH3-10膠條和12.5％SD

4、S-PAGE獲得了p50前胸腺5齡第1、3、5、9天雙向電泳圖譜,背景較低,蛋白斑點(diǎn)清晰。通過圖像掃描和軟件分析發(fā)現(xiàn):5齡期前胸腺2D圖譜存在著較為相似的分布模式,可識別蛋白斑點(diǎn)均在450個(gè)以上,酸性蛋白所占比例較大,分子量25kDa-80kDa區(qū)域蛋白斑點(diǎn)集中,其中25kDa-65kDa,pI4-7區(qū)域尤為密集;5齡期內(nèi)不同發(fā)育時(shí)間內(nèi)蛋白組成有差異但并不劇烈,第1、3、5、9天可識別斑點(diǎn)分別為455、512、501、483個(gè),差異蛋白

5、也以酸性蛋白為主。
　　 通過對5齡第5天p50與秋豐前胸腺2D圖譜的比較發(fā)現(xiàn):蛋白斑點(diǎn)總體分布相似,但種間差異比種內(nèi)差異明顯;秋豐在酸性蛋白區(qū)域蛋白斑點(diǎn)更為密集,536個(gè)可識別蛋白中有超過90％的斑點(diǎn)集中在pI小于7的區(qū)域內(nèi);秋豐較p50有136個(gè)特異點(diǎn),消失的斑點(diǎn)也達(dá)到112個(gè)。
　　 通過對家蠶添食不同外源激素(5齡起蠶添食4.5ug/頭的蛻皮激素和在5齡中期添食0.3ug/頭的保幼激素)均起到了延長齡期的作用。通

6、過雙向電泳分離蛋白后發(fā)現(xiàn),可檢測到的蛋白均超過450個(gè),主要分布模式與未添食激素樣品相似:分子量主要在25kD-80kD,等電點(diǎn)pI3.5-8之間,等電點(diǎn)偏堿性的區(qū)域和小分子量區(qū)域蛋白點(diǎn)的數(shù)量相對比較稀少。添食蛻皮激素后較對照總蛋白斑點(diǎn)數(shù)增加38個(gè),其中新出現(xiàn)蛋白數(shù)約107個(gè),減少約69個(gè);添食保幼激素后總蛋白斑點(diǎn)數(shù)減少58個(gè),其中新出現(xiàn)蛋白點(diǎn)約54個(gè),減少約112個(gè),說明蛻皮激素和保幼激素延長齡期的調(diào)控機(jī)制是不同。
　　 通過

7、前面3個(gè)實(shí)驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)差異蛋白數(shù)量都較多,這可能暗示了蛻皮激素的合成與表達(dá)可能涉及了一個(gè)非常復(fù)雜的多點(diǎn)控制的調(diào)控系統(tǒng),可能涉及不同的調(diào)控位點(diǎn)或調(diào)控因子。
　　 采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)對p50第3、5、9天和秋豐第5天的18個(gè)差異點(diǎn)進(jìn)行分析,得到了這些蛋白斑點(diǎn)的肽質(zhì)量指紋圖譜(PMF),獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中己有的蛋白質(zhì)酶解理論肽質(zhì)量數(shù)或序列相比較,鑒定了如hemolymp