家蠶核型多角體病毒(BmNPV)增殖復(fù)制關(guān)鍵基因的篩選與鑒定.pdf

1、家蠶作為具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的鱗翅目模式昆蟲，在世界的文化傳播、經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。然而每年因蠶病引起的損失占蠶業(yè)總生產(chǎn)的比例高達(dá)25％。家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nuclearpolyhedrovirus，BmNPV）是蠶業(yè)上危害最嚴(yán)重且最常見的一類病原微生物。隨著1999年對BmNPV全基因組序列測定的完成，BmNPV的侵染增殖分子機(jī)制的研究逐漸深入。本研究利用家蠶內(nèi)源性的microRNA骨架，采用RNA

2、i技術(shù)，篩選及鑒定BmNPV增殖復(fù)制的關(guān)鍵基因。主要研究結(jié)果如下:
　　1.BmNPV增殖復(fù)制相關(guān)基因的篩選與克隆
　　根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的桿狀病毒基因功能分析，初步篩選與BmNPV增殖復(fù)制相關(guān)的34個(gè)基因進(jìn)行克隆。其中參與病毒DNA復(fù)制的基因有9個(gè)，參與病毒BV產(chǎn)生的基因有28個(gè)，與核衣殼產(chǎn)生相關(guān)的基因有12個(gè)，影響晚期基因表達(dá)的基因有8個(gè)，影響極晚期基因表達(dá)的基因有7個(gè)。
　　2.BmNPV增殖復(fù)制關(guān)鍵基因的鑒定

3、　　從已初步篩選的34個(gè)基因中最終篩選8個(gè)候選基因作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究對象。這8個(gè)基因分別是:dbp、lef2、lef3、lef7、lef10、lef11、p143、vp1054。分別構(gòu)建這8個(gè)基因?qū)?yīng)的干涉載體和熒光素酶載體，轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后測酶活，發(fā)現(xiàn)lef2和lef11的抑制效果達(dá)到90％以上，dbp、lef3、p143、vp1054抑制效果達(dá)到80％以上，而lef10抑制效果只有12.4％，lef7沒有抑

4、制效果。在病毒的感染率統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，pIZ-DsRed-milefl1轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中病毒的感染率僅為9.16％，pIZ-DsRed-milef10病毒感染率為26.2％，pIZ-DsRed-midbp、pIZ-DsRed-milef3病毒感染率分別為58.4％和54.6％，pIZ-DsRed-mip143和pIZ-DsRed-mivp1054病毒感染率分別是71.1％和67.3％，而pIZ-DsRed-milef2，pIZ-DsRed-mi

5、lef7感染率達(dá)到了100％。以上結(jié)果表明在本研究所篩選的8個(gè)候選基因，lef11是BmNPV增殖復(fù)制的關(guān)鍵基因。
　　3.不同啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的同一干涉載體對病毒增殖復(fù)制的影響
　　將篩選的7個(gè)活性不同的啟動(dòng)子A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70分別替換pIZ-DsRed-milef11中的IE2啟動(dòng)子，并將構(gòu)建的干涉載體轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后測酶活。A4、IE1、IE

6、1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉載體對lef11基因的抑制效果分別是92.6％、97.9％、96.9％、94.8％、95.3％、96.8％、97.9％。在病毒的感染率統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)中，A4、IE1、IE1-295、IE2、IE2-339、hr3A4、hsp70干涉載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中，病毒的感染率分別是18.1％、8.34％、8.41％、11.1％、11.9％、12.1％和11.8％。干涉效果以及對病毒增殖復(fù)制的影響