家蠶核型多角體病毒BmNPV39k啟動(dòng)子的分析與改造.pdf

1、家蠶是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的昆蟲(chóng)，為世界經(jīng)濟(jì)發(fā)展、文化傳播做出了重要貢獻(xiàn)。家蠶血液型膿病是由家蠶核型多角體病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)感染家蠶引起的一種傳染性蠶病，給蠶業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)了巨大危害，提高家蠶品種對(duì)BmNPV的抗性是抗病育種的主要目標(biāo)。近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因RNA干涉技術(shù)興起，該技術(shù)結(jié)合轉(zhuǎn)基因和RNAi的優(yōu)勢(shì)，有望成為培育家蠶抗病毒品種的有效途徑。利用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子能誘發(fā)

2、產(chǎn)生更多siRNA，提高RNAi效率，但是外源基因片段在組成型啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，持續(xù)高量表達(dá)，不僅造成生物體內(nèi)資源的浪費(fèi)，而且對(duì)生物體產(chǎn)生副作用，因此，只有在病源感染條件下才會(huì)驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子逐漸成為研究熱點(diǎn)，在培育家蠶抗性新品種時(shí)，篩選一個(gè)高效合適的病毒誘導(dǎo)型啟動(dòng)子顯得尤為重要。
　　 本研究的主要目的就是為家蠶轉(zhuǎn)基因RNA干涉BmNPV篩選一個(gè)高效的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，為獲得家蠶抗BmNPV的轉(zhuǎn)基因素材奠定前期基礎(chǔ)。本

3、文對(duì)BmNPV誘導(dǎo)型啟動(dòng)子進(jìn)行了篩選，獲得了BmNPV誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，并對(duì)其進(jìn)行改造，構(gòu)建了基于該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)基因干涉載體。主要研究結(jié)果如下:
　　 1、BmNPV啟動(dòng)子的選擇與克隆
　　 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和桿狀病毒的級(jí)聯(lián)調(diào)控特征，參照BmNPV基因功能，初步確定了Bm122、Bm21、P143、39k、P33、VP1054、P6.9這7個(gè)病毒基因的啟動(dòng)子作為篩選病毒誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的對(duì)象。根據(jù)NCBI公布的BmNPV（T3株）

4、基因組序列，分析并克隆了7個(gè)基因ATG上游800-1000bp區(qū)域作為啟動(dòng)子序列，成功構(gòu)建螢火蟲(chóng)熒光素酶重組質(zhì)粒PGL3-Bm122，PGL3-Bm21，PGL3-P143，PGL3-39k，PGL3-P33，PGL3-VP1054，PGL3-P6.9。重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒P-IE1-Rlucp共轉(zhuǎn)染家蠶BmN-SWU1細(xì)胞，運(yùn)用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，分析啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果顯示:與未感染組相比，BmNPV感染72h后，上述7個(gè)基

5、因啟動(dòng)子的熒光素酶相對(duì)比值均有不同程度的上調(diào)，表明BmNPV感染能提高上述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，其中39k啟動(dòng)子感染前后提高了71.9倍，啟動(dòng)子的病毒誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性在上述啟動(dòng)子中最高。由此，將39k啟動(dòng)子作為進(jìn)一步研究的對(duì)象。
　　 2、39k啟動(dòng)子的序列特征與功能分析
　　 對(duì)39k啟動(dòng)子進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)其序列中含有增強(qiáng)子類(lèi)似元件[檢索模式為A（A/T）CGT(G/T)，即CGTGC]、加帽位點(diǎn)（CAGT-motif，是立

6、即早期、延遲早期基因必須的特征性序列）和TATA盒基元序列，符合真核生物啟動(dòng)子特點(diǎn)。
　　 采用PCR法對(duì)39k啟動(dòng)子5'端UTR進(jìn)行分段缺失，構(gòu)建缺失質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞，測(cè)定BmNPV感染后24h、48h、72h相對(duì)酶活，確定了39k啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性最高的區(qū)段是克隆的全長(zhǎng)啟動(dòng)子序列，對(duì)轉(zhuǎn)錄活性起至關(guān)重要的區(qū)段位于TSS(Transcription Start Site)上游-610～-419bp處;39k啟動(dòng)子的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)

7、錄活性區(qū)域位于TSS上游-419至TSS下游31bp處。
　　 將全長(zhǎng)39k啟動(dòng)子質(zhì)粒PGL3-773luc轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞，測(cè)定BmNPV感染后24h、48h、72h相對(duì)酶活，探討39k啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄時(shí)相。結(jié)果表明，在病毒感染24h及以后的各時(shí)間點(diǎn)，39k啟動(dòng)子活性逐漸提高，72h達(dá)到最大，72h與24h相比，相對(duì)酶活差異極其顯著(P＜0.01)，與48h相比，相對(duì)酶活有顯著性差異(P＜0.05)，這符合39k基因是延遲

8、早期基因的特點(diǎn)，并且39k啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性在感染BmNPV后24h～72h內(nèi)具有時(shí)間累積效應(yīng)。
　　 3、39k啟動(dòng)子的改造
　　 桿狀病毒的同源重復(fù)區(qū)hr(homologous regions，hrs)是一種普遍使用的增強(qiáng)元件，桿狀病毒多角體上游基因polh-up(pu)被證實(shí)同樣能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄。將BmNPV來(lái)源的hr3、hr5、polh-up(pu)、hr3-pu克隆至39k全長(zhǎng)啟動(dòng)子上游，以Bmactin基因啟

9、動(dòng)子A4啟動(dòng)子作為陽(yáng)性對(duì)照，分析各個(gè)增強(qiáng)元件的增強(qiáng)效果。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明:無(wú)BmNPV感染時(shí)，39k、hr3-39k、hr5-39k、pu-39k、hr3-pu-39k啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性極低;BmNPV感染后，39k、hr3-39k、hr5-39k、pu-39k、hr3-pu-39k啟動(dòng)子熒光素酶相對(duì)比值不同程度地上調(diào)，具有BmNPV誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄活性;hr3的增強(qiáng)效果要強(qiáng)于pu、hr5，與39k啟動(dòng)子相比，相對(duì)酶活提高了4.38倍;hr3和pu

10、共同作用，增強(qiáng)作用更加明顯，與39k啟動(dòng)子相比，酶活提高了14.3倍;與組成型強(qiáng)啟動(dòng)子A4相比，相對(duì)酶活提高了2.147倍。上述結(jié)果表明polh和hr3聯(lián)合作用，能夠顯著提升BmNPV39k啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。與此同時(shí)，上述39k啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)DsRed達(dá)，轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞，DsRed發(fā)光情況與熒光素酶活性分析的結(jié)果一致。由此確定hr3-polh的增強(qiáng)作用最強(qiáng)，hr3-polh-39k啟動(dòng)子將用于后續(xù)RNAi研究。
　　 4、

11、細(xì)胞水平檢測(cè)39k啟動(dòng)子shRNA干涉效果
　　 為了檢測(cè)hr3-pu-39k啟動(dòng)子能否在家蠶細(xì)胞水平驅(qū)動(dòng)shRNA轉(zhuǎn)錄，誘發(fā)RNA干涉，從而實(shí)現(xiàn)特異性的基因沉默，設(shè)計(jì)合成3條特異性針對(duì)BmNPVlef-1基因的特異性靶標(biāo)序列，由hr3-pu-39k啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，分別構(gòu)建PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA干涉載體和PGL3-A4-luc-lef-1表達(dá)載體。
　　 PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA

12、、PGL3-A4-luc-lef-1和內(nèi)參質(zhì)粒P-1E1-Rlucp共轉(zhuǎn)染BmN-SWU1細(xì)胞，感染后72h收集細(xì)胞，檢測(cè)熒光素酶活性。BmNPV感染后72h，實(shí)驗(yàn)組（PIZ/V5-hr3-pu-39k-shRNA）的熒光素酶相對(duì)比值與對(duì)照組相比，明顯下降。實(shí)驗(yàn)組感染前后，相對(duì)酶活差異性極其顯著(P＜0.01)，干擾序列能在mRNA水平抑制lef-1基因的表達(dá)，抑制效果高達(dá)85％以上，表明在細(xì)胞水平，BmNPV能夠誘導(dǎo)39k啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)s