家蠶核型多角體病毒ORF75基因的克隆及表達.pdf

1、根據(jù)GenBank發(fā)表的序列(L33180)設計引物，以家蠶核型多角體病毒為材料，利用PCR技術擴增了編碼家蠶核型多角體病毒(BombyxmoriNucleopolyhedrovirus,BmNPV)ORF75基因的DNA片段，將其克隆至pMD18-Tvector上，獲得了該基因成熟蛋白閱讀框序列。利用設計的酶切位點將目的基因從T載體上切下。目的片斷和表達質粒pGEX-4T-2經(jīng)BamHI/XhoI雙酶切，連接得到重組表達質粒pGEX/

2、Bm75。將重組表達質粒pGEX/Bm75轉化入大腸桿菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導表達后，SDS-PAGE分析表明產(chǎn)生57kDa左右的特異蛋白質條帶。為了進一步檢測表達產(chǎn)物是不是含有與GST融合的蛋白，以MouseAnti-GST為第一抗體，以辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠為二抗，對表達產(chǎn)物進行Westernblotting分析，結果表明，pGEX/Bm75經(jīng)IPTG誘導產(chǎn)生的57kDa蛋白條帶與抗體發(fā)生了很強的交叉反應，表明融合蛋白得到了

3、表達。該融合蛋白含有一個GST，可以在對融合蛋白進行親和層析的同時，結合相應的蛋白酶切割實現(xiàn)目的蛋白的純化。 本實驗并對家蠶核型多角體病毒ORF75基因核苷酸序列進行了生物信息學分析，BmNPVORF75基因位于70485bp和71264bp之間，編碼一個259個氨基酸殘基的多肽，預測分子量為30.8kDa,等電點為7.67，分子式為C1409H2157N351O390S19；蛋白在大腸桿菌內的半衰期大于10個小時；酸性氨基酸(

4、Asp+Glu)占10.5％，堿性氨基酸(Arg+Lys)占10.8％；蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為42.67，是不穩(wěn)定蛋白。對Prosite數(shù)據(jù)庫掃描，查到4類9個蛋白修飾位點。通過Blast搜索氨基酸同源序列發(fā)現(xiàn)，Bm75同源蛋白存在于所有測序的鱗翅目桿狀病毒，不存在于其他非鱗翅目昆蟲桿狀病毒中。這表明，Bm75同源蛋白可能是鱗翅目桿狀病毒所特有的。從同源序列比對的結果來看，Bm75蛋白的氨基酸序列與苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autogra