家蠶核型多角體病毒BmNPV orf90基因的功能研究.pdf

1、家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV）是核型多角體病毒屬的典型代表，近年來(lái)，對(duì)BmNPV基因功能的探索從未停止，但仍有很多基因的功能未知。BmNPV orf90（Bm90）基因是BmNPV基因組中一個(gè)未知功能的保守基因，本文以Bm90基因?yàn)檠芯繉?duì)象，深入研究該基因在整個(gè)病毒感染周期中對(duì)病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及組裝等方面的影響。
　　利用λRed重組系統(tǒng)和Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)

2、建帶有多角體基因（polh）和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因（egfp）的野生型病毒W(wǎng)tBacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfp-Bacmid及 Bm90基因回補(bǔ)型病毒Bm90re-polh-egfp-Bacmid。將3種重組病毒分別轉(zhuǎn)染家蠶卵巢細(xì)胞BmN，病毒滴度測(cè)定發(fā)現(xiàn)Bm90基因缺失型病毒的滴度值為零，即Bm90基因缺失使病毒失去了產(chǎn)生侵染性子代病毒粒子的能力。收集轉(zhuǎn)染重組病毒48 h后的B

3、mN細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡觀察，進(jìn)而分析Bm90基因缺失對(duì)子代病毒粒子組裝的影響，電鏡觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)在野生型和回補(bǔ)型病毒轉(zhuǎn)染的BmN細(xì)胞中存在大量的子代病毒粒子及病毒發(fā)生基質(zhì)，而B(niǎo)m90基因缺失型病毒轉(zhuǎn)染的BmN細(xì)胞中沒(méi)有子代病毒粒子及其他典型的桿狀病毒感染癥狀出現(xiàn)，表明Bm90基因是子代病毒粒子組裝的必需基因。qPCR分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型與回補(bǔ)型病毒的復(fù)制水平在12 h到96 h不斷增加且兩者差異不顯著；而B(niǎo)m90基因缺失型病毒的復(fù)制水平在12

4、 h到48 h不斷增加，與野生型和回補(bǔ)型病毒復(fù)制水平相當(dāng)，但48 h后Bm90基因缺失型病毒復(fù)制水平保持不變且顯著低于野生型和回補(bǔ)型病毒的復(fù)制水平（P<0.05），表明Bm90基因不是病毒復(fù)制的必需基因，但顯著影響病毒的復(fù)制水平。qRT-PCR分析結(jié)果顯示Bm90基因的缺失使家蠶核型多角體病毒BmNPV早期基因lef-3、晚期基因vp39和極晚期基因p10的轉(zhuǎn)錄水平均具有顯著性的下調(diào)(P<0.05)，表明Bm90基因在病毒周期中對(duì)其他病