家蠶品系871與871C抗家蠶核型多角體病毒(BmNPV)的差異及機(jī)制研究.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的馴化昆蟲，同時(shí)也是鱗翅目模式昆蟲，家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）是對(duì)蠶業(yè)危害最為嚴(yán)重的家蠶病原微生物之一，由BmNPV引起的家蠶血液型膿病常對(duì)蠶業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。該病傳染性強(qiáng)、難以控制，雖然傳統(tǒng)的消毒方法能夠在一定程度上預(yù)防該病的發(fā)生，但仍具有很大局限性。因此，對(duì)BmNPV的侵染機(jī)制、家蠶對(duì)BmNPV抗性機(jī)制和培

2、育抗性家蠶素材的研究成為當(dāng)前蠶學(xué)領(lǐng)域最為緊迫的課題。雖然BmNPV與宿主相互作用研究已取得了不少成果，許多參與家蠶與病毒互作和具有抗病毒功能的基因已被發(fā)現(xiàn)和鑒定，但是，對(duì)于BmNPV侵染家蠶過程的分子機(jī)制仍不十分清楚，在BmNPV感染家蠶的過程中有哪些宿主基因或通路參與？BmNPV如何通過調(diào)控宿主細(xì)胞以利于自身復(fù)制增殖？這一系列的問題都亟待進(jìn)一步研究。本研究檢測(cè)并鑒定了兩種抗性差異家蠶品系871與871C對(duì)BmNPV的抗性差異和組織感染

3、差異；分析了BmNPV在不同品系間的入侵和感染過程，并確定了BmNPV在抗性品系中被阻斷的時(shí)期；進(jìn)一步通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)解析了871與871C抗性差異品系間的差異表達(dá)基因，并成功篩選得到一個(gè)具有顯著抑制BmNPV復(fù)制增殖能力的差異候選基因。主要研究結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1.871與871C對(duì)BmNPV抗性的鑒定
　　通過定量添食家蠶核型多角體病毒后家蠶死亡統(tǒng)計(jì)檢測(cè)，871對(duì)BmNPV的半致死劑量（LD50）為3.8×103多角

4、體/頭，871C的半致死劑量為2.5×107多角體/頭，871C較871對(duì)BmNPV感染呈明顯抗性。通過添食病毒后（2×106多角體/頭）家蠶存活曲線分析表明，871死亡高峰在第5天，871C死亡高峰在第8天，表明871C感染BmNPV后具有顯著的死亡延后現(xiàn)象。皮下注射（2×104 BV/頭）存活曲線分析表明，871在感染第8天幾乎全部死亡（99%），而871C少量死亡（8%）。病征觀察結(jié)果顯示，871感染病毒后第3天出現(xiàn)體型變小、體重

5、減輕現(xiàn)象，隨后出現(xiàn)體形腫脹，體色乳白，狂躁爬行，皮破流膿的典型血液型膿病特征，然而在871C在感染BmNPV后在第5天與對(duì)照組出現(xiàn)差異，但未出現(xiàn)明顯病癥。通過解剖觀察，發(fā)現(xiàn)871病蠶體內(nèi)充滿病毒多角體，脂肪體消融，中腸易破等現(xiàn)象；血細(xì)胞連續(xù)觀察和統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析顯示，在感染后48h，敏感品系871血細(xì)胞中即出現(xiàn)病毒多角體，并隨時(shí)間推移多角體逐漸增多，感染后96h，血細(xì)胞內(nèi)充滿病毒多角體，且血液中存在較多游離病毒多角體。871C至感染后96h

6、觀察到少量病毒多角體的產(chǎn)生。組織切片觀察顯示871中腸在感染后24h出現(xiàn)細(xì)胞核膨大的病變現(xiàn)象，隨后病變程度增加，到感染后96 h出現(xiàn)細(xì)胞核脫落現(xiàn)象。871C在感染BmNPV后，至96h未觀察到明顯變化?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)分析，確定了871C與871對(duì)BmNPV的抗性差異。同時(shí)也確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)口感染劑量為2×106多角體/頭，注射實(shí)驗(yàn)劑量為2×104BV/頭。
　　2. BmNPV感染871與871C的過程及組織差異
　　通過收集不

7、同時(shí)間點(diǎn)兩種家蠶品系的各個(gè)組織，通過qRT-PCR連續(xù)檢測(cè)病毒基因表達(dá)水平，鑒定經(jīng)口添食BmNPV在871與871C的感染過程。結(jié)果表明，871C經(jīng)口感染后6h，在家蠶中腸檢測(cè)到病毒；12h在血細(xì)胞和脂肪體檢測(cè)到病毒；24h頭部和氣管檢測(cè)到病毒；48h，表皮組織中檢測(cè)到病毒；72h檢測(cè)到病毒感染絲腺及生殖腺。這些結(jié)果表明，BmNPV初始感染家蠶中腸，隨后進(jìn)入血液與脂肪體進(jìn)行二次感染，進(jìn)而感染家蠶頭部、表皮和氣管細(xì)胞，最后BmNPV感染家

8、蠶絲腺與生殖腺?？剐云废?71C與敏感品系871在BmNPV的感染過程中沒有差異。利用qRT-PCR檢測(cè)BmNPV在871與871C不同組織中病毒晚期基因vp39的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：同一品系的不同組織比較發(fā)現(xiàn)，家蠶血液和脂肪體感染程度最高，其次是中腸、頭部、表皮和氣管，絲腺和生殖腺的感染程度最低。不同品系間相同組織比較結(jié)果顯示，871中vp39表達(dá)水平較871C均在2倍以上，表明BmNPV對(duì)871C與871的各個(gè)組織感染程度存在顯出差

9、異。通過帶有EGFP熒光標(biāo)簽的示蹤病毒觀察病毒組織感染情況，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了組織感染的差異性。
　　3.BmNPV侵染關(guān)鍵組織的差異分析
　　桿狀病毒感染宿主昆蟲，存在初始感染和系統(tǒng)性感染兩個(gè)階段。在BmNPV感染家蠶過程中，病毒初始感染進(jìn)入中腸和在中腸中的復(fù)制對(duì)其系統(tǒng)性感染至關(guān)重要。通過經(jīng)口添食和皮下注射，對(duì)BmNPV感染過程中中腸和血淋巴的感染情況進(jìn)行了檢測(cè)。分析發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過熒光增白劑（FB280.05%）處理后，871與

10、871C感染BmNPV相比與未經(jīng)處理的對(duì)照組死亡時(shí)間提前1～2天，死亡率顯著增加，表明家蠶圍食膜對(duì)BmNPV的感染具有重要的防御作用；但兩個(gè)品系對(duì)BmNPV的敏感性變化未出現(xiàn)差異，表明圍食膜的屏障作用并不是影響兩者抗性差異的主要因素。BmNPV經(jīng)口感染后6h，對(duì)中腸中病毒DNA拷貝數(shù)和vp39表達(dá)水平檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，兩者無顯著差異，表明BmNPV在入侵871與871C中腸細(xì)胞過程中兩者沒有差異。通過檢測(cè)BV粒子與兩種家蠶血清溫育后病毒毒力

11、的變化，發(fā)現(xiàn)871與871C的血清對(duì)病毒毒力沒有顯著影響。皮下注射感染24h后，均能夠在血細(xì)胞中觀察到綠色熒光，表明BV粒子均能夠進(jìn)入871與871C的血淋巴細(xì)胞。通過對(duì)注射感染后血細(xì)胞中病毒DNA拷貝數(shù)與病毒vp39表達(dá)水平的檢測(cè)，在感染3h病毒DNA拷貝數(shù)與vp39表達(dá)量基本一致，表明病毒粒子進(jìn)入血細(xì)胞沒有差異。綜合871與871C中腸細(xì)胞和血細(xì)胞中BmNPV的DNA復(fù)制水平和基因表達(dá)水平分析結(jié)果，表明BmNPV在感染過程中均能夠入

12、侵兩者細(xì)胞內(nèi)，但隨后BmNPV在受感染的細(xì)胞中的增殖出現(xiàn)了差異，暗示著抗性品系871C存在胞內(nèi)抑制病毒的復(fù)制和增殖機(jī)制。
　　4.BmNPV增殖被阻斷時(shí)期的分析
　　通過收集皮下注射后的兩種家蠶品系的血細(xì)胞在BmNPV感染后3h、6h、12h、24h和48h的RNA，反轉(zhuǎn)錄分別獲得cDNA文庫，基于BmNPV的立即早期基因ie-1、早期基因gp64、晚期基因vp39和lef-3、以及極晚期基因p10表達(dá)時(shí)序性，通過qRT-P

13、CR分析BmNPV在宿主細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)過程。結(jié)果表明，兩種家蠶中感染后3h和6h及以內(nèi)ie-1，gp64，vp39均能夠低量表達(dá)，且兩者沒有明顯差異。說明病毒在感染初期并沒有受到抗性機(jī)制的影響；在感染12h及以后這些基因在兩種差異品系中表達(dá)水平出現(xiàn)顯著差異，且隨后在871C中下調(diào)表達(dá)。同時(shí)檢測(cè)了ie-1、vp39和p10在兩種家蠶品系脂肪體和中腸表達(dá)情況，結(jié)果與血細(xì)胞中的一致。以上結(jié)果顯示BmNPV在感染早期被抑制，表明871C存在某

14、種抗病毒機(jī)制抑制了病毒部分早期基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致了病毒的復(fù)制增殖被阻斷。
　　5.轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析兩品系的差異基因
　　為了進(jìn)一步解析該差異機(jī)制，選取兩品系未感染及感染后12h、24h、48h的家蠶中腸，構(gòu)建8個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，得到1031差異表達(dá)基因。其中BmNPV感染分別引起敏感品系871和抗性品系871C中749個(gè)和381個(gè)基因發(fā)生顯著變化。GO分析分析這些差異基因主要集中在代謝、催化活性、細(xì)胞進(jìn)程、結(jié)合

15、、細(xì)胞組分等，KEGG分析顯示，這些差異基因主要參與能量代謝、氨基酸的代謝、糖類代謝、次級(jí)產(chǎn)物代謝等。同時(shí)我們觀察到BmNPV對(duì)871的影響大于871C，暗示了BmNPV可能劫持了宿主細(xì)胞基本代謝通路用于自身復(fù)制增殖。不同品系間差異基因共有773個(gè)，抗性家蠶品系871C在模式識(shí)別、免疫通路、細(xì)胞凋亡、效應(yīng)分子等多種抗病毒通路基因表達(dá)均高于敏感品系871。通過對(duì)差異基因分析，發(fā)現(xiàn)差異基因BGIBMGA003660基因不僅在871C中高表達(dá)

16、，其表達(dá)水平是871的5.25倍，同時(shí)在BmNPV感染家蠶后該基因也上調(diào)表達(dá)，且該基因與其他昆蟲C-type Lectin（具有抗感染等免疫功能）具有很高的同源性，暗示該基因可能具有抑制BmNPV增殖的作用，因此我們將BGIBMGA003660基因作為候選基因進(jìn)行深入研究。
　　6.BmCTL-S5基因的克隆表達(dá)及抗病毒功能分析
　　為了鑒定候選基因（BGIBMGA003660）在BmNPV復(fù)制增殖中的功能特征，本研究成功克

17、隆了BGIBMGA003660（BmCLT-S5）基因并對(duì)該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示該蛋白包含一個(gè)EPQ（Glu-Pro-Gln）保守基序和CRD保守結(jié)構(gòu)域，其N-端含有21aa的信號(hào)肽。對(duì)該蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明，BmCLT-S5蛋白均勻的分布于細(xì)胞質(zhì)中。RT-PCR分析顯示BmCLT-S5在抗性品系（871C）中表達(dá)顯著高于敏感品系（871），BmNPV感染后該基因上調(diào)表達(dá)，且871C表達(dá)水平顯著高于871。過表達(dá)

18、piZBmCTL-S5Flag結(jié)果顯示過表達(dá)的細(xì)胞中沒有檢測(cè)病毒的熒光信號(hào)，能夠明顯抑制BmNPV增殖復(fù)制；進(jìn)而篩選該基因過表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系感染BmNPV后，發(fā)現(xiàn)該基因能夠在基因表達(dá)水平，DNA復(fù)制水平和病毒增殖水平有效抑制病毒增殖。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BmCLT-S5的Cas-9敲除載體Cas9-CTL，結(jié)果表明敲除載體能夠顯著編輯BmCLT-S5基因，敲除該基因能夠明顯促進(jìn)病毒復(fù)制增殖。以上結(jié)果表明BmCLT-S5具有顯著抑制BmNPV復(fù)制增殖