家蠶核型多角體病毒中RNA干擾抑制子的篩選與鑒定研究.pdf

1、RNAi是由dsRNA觸發(fā)的高度保守的基因表達調(diào)控機制，在植物和昆蟲中，RNAi是一種主要的抗病毒防御機制。病毒進入宿主后，其復制過程中形成的dsRNA在宿主 RNA酶Ⅲ Dicer2的作用下，被切割成21-23nt的siRNA，siRNA隨后被組裝到RISC中，引導AGO2切割與其互補配對的mRNA，從而阻斷病毒的復制。然而許多植物和動物病毒也進化出了RNAi的抑制子----VSR，來抑制宿主的抗病毒途徑。這些VSR都是在病毒感染宿主

2、過程中起到重要作用的蛋白，但它們在基因序列和病毒結構上并不保守，而且在RNAi機制中的作用位點也不相同。比如，F(xiàn)HV B2蛋白和DCV的1A蛋白可以與dsRNA結合，阻止dsRNA被識別及剪切成siRNA。FHVB2蛋白也可以與siRNA結合，阻止RISC的組裝。而CrPV的1A蛋白、TCV的P38蛋白、poleorviruses的P0蛋白等通過與AGO2蛋白相互作用，阻止RISC的組裝或作用于RNAi的效應階段。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，與A

3、GO蛋白作用的一部分RNA干擾抑制子，通過保守的GW/WG motif與AGO蛋白結合，從而抑制RNAi應答。研究稱，AGO蛋白中發(fā)揮與GW/WG motif結合功能是PIWI結構域。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴體外合成兩條針對螢火蟲熒光素酶的雙鏈RNA----dsFluc1和 dsFluc2，將其與雙熒光素酶報告基因共同轉染BmN4-SID1細胞，對酶活的測定結果顯示，兩條dsRNA均抑制螢火蟲熒光素酶的表達，即其均觸發(fā) RNA

4、i機制。而dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi效應強于dsFluc1，因此選擇dsFluc2進行實驗。在未感染的BmN4-SID1細胞中，dsFluc2干涉引發(fā)的RNAi對螢火蟲熒光素酶的沉默為dsRed的5倍，而在BV病毒感染的細胞中，這種基因沉默的現(xiàn)象基本得到回復，顯示BmNPV可以抑制家蠶BmN4-SID1細胞中的RNAi過程。⑵用Blastx的方法在TCV、SPMMV和ToRSV的總蛋白中篩選含GW/WG motif的蛋白，分別得到

5、2個、5個和5個含GW/WG motif的蛋白，發(fā)現(xiàn)已報道的這三個病毒的VSR-P38、P1和CP蛋白分別位于其中，證明可以用這種方法找出病毒中含GW/WG motif的抑制子。對BmNPV中含GW/WG motif的蛋白進行篩選，共得到16個蛋白，按照功能不同將其分為四類：結構蛋白、復制和表達相關蛋白、宿主機體調(diào)節(jié)蛋白及其他功能蛋白。這些蛋白在病毒DNA的復制、完整病毒粒子的組裝、病毒進入宿主以及子代病毒的釋放等過程中分別顯示出重要功

6、能。包膜蛋白GP64/67、ODV-E66和衣殼蛋白orf1629，38K和VP39是構成病毒粒子的主要蛋白，并在蛋白進入宿主和出芽過程中起重要作用。P47，DNA Polymerase和DNA Helicase作用于病毒DNA的復制，影響病毒增殖。Cystein Protease，Chitinase和 p35調(diào)節(jié)宿主細胞狀態(tài)，病毒在宿主體內(nèi)復制及組裝完成后，需要借助于前兩者對宿主機體的降解和液化來把釋放子代病毒，而受感染的細胞為保護同

7、伴，會啟動“自殺”程序——細胞凋亡來阻止病毒大量擴增，p35則作用于抑制細胞凋亡過程，幫助病毒為所欲為地在宿主體內(nèi)擴增，并且研究發(fā)現(xiàn)p35在AcMNPV中的同源基因是RNAi的抑制子。P33、orf4和P48作用于BV增殖、ODV組裝及成熟子代病毒產(chǎn)生，PIF1介導ODV進入宿主細胞膜，P43功能未知。另外，用VSR預測網(wǎng)站對 BmNPV的總蛋白進行預測，篩選出5個預測值最高的蛋白，分別是DNA Polymerase，ODV-E66，以

8、及作用于病毒基因的復制和表達過程的 IE-1和LEF-3，包膜蛋白orf14。⑶對預測的14個基因進行克隆及表達載體的構建，分別是BmNPV-p35、LEF-3、IE1、GP64、Chitinase、Cystein protease、PIF1、orf1629、P47、P43、P48、orf4和VP39。對基因進行T克隆，測序驗證正確后構建過表達載體，雙酶切及測序驗證正確顯示過表達載體構建成功，得到pSLfa1180[Hr3-A4-Gen

9、e-SV40]。orf14通過Gateway方法構建到pie2FW載體中。向家蠶細胞中轉染過表達載體，定量PCR檢測顯示目標基因均能在細胞中轉錄表達。初步選擇9個候選基因進行鑒定，分別是IE1、orf4、P48、p35、LEF-3、orf1629、P47、VP39和P43。同樣借助BmE細胞中dsFluc2干涉對雙熒光素酶報告基因中螢火蟲熒光素酶基因的沉默現(xiàn)象，向細胞中同時轉染過表達載體，Western Blot檢測顯示9個基因均在家蠶