禽類病毒RNA沉默抑制子的篩選鑒定及功能分析.pdf

1、RNA沉默(RNA silencing)是一種普遍存在于真核生物體內(nèi)用以抵御病毒和外來核酸入侵的特異性RNA降解機(jī)制。針對(duì)這一防御機(jī)制，病毒通常通過編碼RNA沉默抑制子(RNA silencing suppressors，RSSs)阻礙沉默的產(chǎn)生和傳播，保證其成功侵染。迄今為止，已經(jīng)鑒定出80多個(gè)RNA沉默抑制子，其中大多數(shù)來自植物病毒。已鑒定的RSSs大多為蛋白質(zhì)，它們之間沒有序列同源性，結(jié)構(gòu)上也表現(xiàn)高度多樣，這反映出RNA沉默機(jī)制及

2、病毒、寄主互作的復(fù)雜性。因此，更多新的沉默抑制子的鑒定及功能分析，有利于深入細(xì)致地了解RNA沉默機(jī)制及寄主、病毒互作規(guī)律，為更有針對(duì)性控制病毒提供理論基礎(chǔ)；另外，篩選獲得的沉默抑制子與目的基因共表達(dá)，可以提高蛋白表達(dá)水平，為異源蛋白表達(dá)研究提供新策略。本研究選取6種禽類病毒編碼蛋白，利用農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)其RNA沉默抑制功能進(jìn)行鑒定，并對(duì)其中沉默抑制功能明確的HVT063和NS1的沉默抑制特點(diǎn)及作用機(jī)理進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下：

3、
　　 (1)候選RNA沉默抑制蛋白的初步篩選鑒定。根據(jù)已知RNA沉默抑制子多為dsRNA(double-stranded RNA，雙鏈RNA)、siRNA(small interfering RNA，小分子干擾RNA)結(jié)合蛋白或致病相關(guān)因子等特點(diǎn)，初步選定4種禽類病毒(包括DNA病毒和RNA病毒)編碼的6種蛋白為候選蛋白，克隆這些候選蛋白基因并構(gòu)建到植物表達(dá)載體pBI121中，以綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因本生煙為材料，利用農(nóng)

4、桿菌瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)鑒定其沉默抑制作用。侵染后的第3天，HVT063蛋白和NS1蛋白共侵染區(qū)都有很強(qiáng)的GFP表達(dá)，因此被初步確定為RNA沉默抑制子，而其余4種候選蛋白不具有沉默抑制功能。HVT063蛋白是首次鑒定的由皰疹病毒科編碼的RNA沉默抑制子，本研究中的NS1蛋白來自H9N2型禽流感病毒，其沉默抑制活性也是首次被鑒定。
　　 (2)HVT063能夠有效抑制局部性RNA沉默和系統(tǒng)性RNA沉默。HVT063與GFP共表達(dá)，其共侵染

5、區(qū)在侵染后第3天和第6天都有較強(qiáng)的GFP表達(dá)，GFP mRNA的積累水平較高，而GFP siRNA幾乎檢測不到。將HVT063基因起始密碼子ATG突變成纈氨酸密碼子GTG(mHVT063)，使其只能轉(zhuǎn)錄不能翻譯，侵染后第3天時(shí)，共侵染區(qū)幾乎檢測不到GFP表達(dá)。說明HVT063發(fā)揮沉默抑制作用的是HVT063蛋白本身不是其mRNA。HVT063也能夠抑制系統(tǒng)性RNA沉默。侵染后第13天時(shí)，mHVT063共侵染植株上部葉片GFP已發(fā)生沉默，

6、而HVT063共侵染植株上部新生葉片仍然保持GFP熒光，且GFP mRNA積累水平明顯高于mHVT063處理。HVT063既能有效抑制由單鏈RNA誘發(fā)的沉默也能抑制由dsRNA誘發(fā)的沉默，由此推測，HVT063蛋白可能作用于沉默過程中dsRNA形成的下游，通過與siRNA相結(jié)合，阻礙siRNA整合到沉默蛋白復(fù)合體RISC，或與RISC復(fù)合體中某種蛋白互作，從而抑制RNA沉默途徑。
　　 (3)用病毒表達(dá)載體PVX進(jìn)一步證實(shí)HVT

7、063的沉默抑制活性，但PVX-HVT063不能逆反已建立的系統(tǒng)性沉默。用病毒表達(dá)載體PVX表達(dá)的HVT063也能增強(qiáng)共侵染區(qū)GFP的表達(dá)，顯著提高GFP mRNA和PVX RNA的積累水平，而PVX-mHVT063卻不具有此功能。PVX載體沉默逆反試驗(yàn)表明，HVT063能逆反局部性沉默，但不能逆反已建立的整株系統(tǒng)性沉默。推測HVT063不能阻止RNA沉默在植株內(nèi)的傳播，只在RNA沉默的維持階段起作用。
　　 (4)堿性氨基酸殘

8、基在HVT063沉默抑制活性中的功能。大多數(shù)動(dòng)物病毒RNA沉默抑制子是通過與dsRNA或siRNA相結(jié)合抑制RNA沉默途徑。HVT063蛋白包含兩個(gè)堿性氨基酸密度較高的區(qū)域--1區(qū)和2區(qū)。這些堿性氨基酸是否與RNA的結(jié)合有關(guān)從而對(duì)HVT063的沉默抑制功能起關(guān)鍵作用呢?我們將這兩個(gè)區(qū)域中的全部11個(gè)精氨酸(R)和賴氨酸(K)分別突變成丙氨酸(A)，檢測RNA沉默抑制功能的變化。結(jié)果顯示，11個(gè)位點(diǎn)的堿性氨基酸每個(gè)單突變后均減弱了HVT0

9、63的沉默抑制功能，1區(qū)中的4個(gè)堿性氨基酸其中3個(gè)(138K、139R、140R)突變后HVT063完全失去沉默抑制活性，因此推測1區(qū)可能參與了HVT063關(guān)鍵功能域的形成；而2區(qū)的191R和193R突變后也使HVT063完全喪失功能。以上這些氨基酸可能直接參與了HVT063與RNA的結(jié)合或與沉默抑制功能直接相關(guān)。
　　 (5)HVT063沉默抑制活性與濃度有關(guān)且高濃度HVT063抑制沉默的同時(shí)引起侵染區(qū)細(xì)胞部分壞死。為了進(jìn)一步

10、明確HVT063的沉默抑制功能、細(xì)胞致死能力與其表達(dá)量之間的關(guān)系，設(shè)置不同濃度梯度的HVT063重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌進(jìn)行共侵染試驗(yàn)，結(jié)果表明，隨著重組質(zhì)粒農(nóng)桿菌稀釋倍數(shù)的增加，其RNA沉默抑制能力及細(xì)胞致死能力都呈現(xiàn)下降趨勢。因此，HVT063的RNA沉默抑制功能和細(xì)胞致死能力均具有劑量依賴性。
　　 (6)NS1能抑制單鏈RNA和雙鏈RNA引發(fā)的局部和系統(tǒng)性沉默，1～70位氨基酸是沉默抑制功能的關(guān)鍵功能域。將NS1與已鑒定的強(qiáng)沉默抑

11、制子p19的RNA沉默抑制能力進(jìn)行了比較，研究表明，侵染后7到10天，NS1局部沉默抑制能力顯著強(qiáng)于p19；其余檢測時(shí)間弱于p19。NS1能抑制系統(tǒng)性沉默，但不能徹底阻止沉默信號(hào)的在整株內(nèi)系統(tǒng)性傳播。突變分析表明，NS1的35位和46位精氨酸突變?yōu)楸彼岷髥适С聊种乒δ?，是沉默抑制功能域的必需氨基酸?1位精氨酸突變成丙氨酸不影響抑制功能。缺失71～230位氨基酸的突變體能抑制單鏈RNA引起的沉默但不能抑制雙鏈RNA引起的基因沉默，說