中國(guó)番茄黃化曲葉病毒及其衛(wèi)星DNAβ編碼的RNA沉默抑制子的作用機(jī)理.pdf

1、中國(guó)番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)是我國(guó)發(fā)現(xiàn)的一個(gè)單組分雙生病毒，該病毒近幾年在我國(guó)云南、廣西等地的煙草和番茄等多種植物上發(fā)病嚴(yán)重。前期研究發(fā)現(xiàn)TYLCCNV的βC1、AC2和AC4為RNA沉默抑制子，但它們抑制RNA沉默的作用機(jī)理并不清楚。本論文對(duì)βC1、AC2和AC4抑制RNA沉默的作用機(jī)理進(jìn)行了研究。 農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)轉(zhuǎn)GFP基因本氏煙試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，βC1和GFP共浸潤(rùn)5天后局部GFP mRNA和GFP蛋白的積累量明顯高于空載

2、體和突變體與GFP共浸潤(rùn)的植株，進(jìn)一步驗(yàn)證了βC1是RNA沉默抑制子。利用電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)對(duì)βC1蛋白與單、雙鏈RNA和siRNA的結(jié)合特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)βC1蛋白能結(jié)合單鏈RNA(ssRNA)而不能結(jié)合雙鏈RNA(dsRNA)，說明βC1蛋白可能不是通過干擾Dicer切割dsRNA來抑制RNA沉默。Northern印跡分析也表明，βC1蛋白并沒有完全消除siRNA的產(chǎn)生而是明顯減少了siRNA的積累量。βC1蛋白能與單鏈

3、siRNA結(jié)合卻不能與雙鏈siRNA結(jié)合，其結(jié)合單鏈siRNA的能力隨著蛋白量的增加而增強(qiáng)，說明βC1蛋白可能通過抑制沉默復(fù)合體(RISC)的活性來抑制RNA沉默，而不是與siRNA結(jié)合而阻止RISC的形成。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，βC1蛋白能夠抑制系統(tǒng)沉默和沉默信號(hào)的系統(tǒng)傳導(dǎo)，與陽(yáng)性對(duì)照CMV 2b相似。據(jù)此推測(cè)βC1也可能跟CMV 2b一樣，通過干擾沉默信號(hào)的長(zhǎng)距離移動(dòng)來抑制RNA沉默。 利用原核表達(dá)載體pET-32a在大腸桿菌中表

4、達(dá)了中國(guó)番茄黃化曲葉病毒的AC2和AC4基因，并在自然條件下分別純化了這兩個(gè)蛋白。通過EMSA對(duì)AC2蛋白與單、雙鏈RNA和siRNA的結(jié)合特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AC2蛋白既能結(jié)合單、雙鏈RNA，也能結(jié)合單、雙鏈siRNA，其結(jié)合能力隨著蛋白量的增加而增強(qiáng)，說明AC2蛋白可能通過干擾Dicer切割dsRNA來抑制RNA沉默，也可能與siRNA結(jié)合而阻止RISC的形成從而抑制RNA沉默，還可能通過抑制RISC的活性來抑制RNA沉默。