番茄黃化曲葉病毒編碼的V2蛋白抑制轉(zhuǎn)錄水平基因沉默研究.pdf

1、番茄黃化曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl virus，TYLCV)是隸屬于菜豆金色花葉病毒屬的單組份雙生病毒，能夠在寄主植物上引起嚴(yán)重的葉片黃化、下卷及矮化等癥狀。自2006年先后在上海番茄上發(fā)現(xiàn)TYLCV后，TYLCV引起的番茄黃化曲葉病在我國(guó)發(fā)展兇猛并已呈擴(kuò)展蔓延的趨勢(shì)，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。TYLCV編碼的V2蛋白是一個(gè)RNA沉默抑制子，能抑制轉(zhuǎn)錄后基因沉默(Post-transcriptional gene

2、 silencing，PTGS)，但對(duì)其是否抑制轉(zhuǎn)錄水平基因沉默(Transcriptional gene silencing，TGS)沒(méi)有報(bào)道。為了進(jìn)一步弄清TYLCV編碼的V2蛋白在TYLCV侵染及致病中的作用，我們對(duì)V2蛋白抑制TGS進(jìn)行了探究。
　　通過(guò)TYLCV侵染性克隆接種16-TGS植株，明確TYLCV病毒自身可以抑制TGS。隨后，利用馬鈴薯X病毒(Potato virus X, PVX)異源病毒表達(dá)載體表達(dá)病毒蛋白

3、并接種16-TGS植株，發(fā)現(xiàn)V2蛋白能夠像TYLCV那樣回復(fù)GFP轉(zhuǎn)基因的TGS。亞硫酸氫鹽測(cè)序和甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶PCR實(shí)驗(yàn)表明TYLCV或PVX-V2接種的16-TGS植株中35S啟動(dòng)子胞嘧啶甲基化受到抑制。在此基礎(chǔ)上，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得在擬南芥中穩(wěn)定表達(dá)V2的擬南芥遺傳材料，與野生型植株相比，轉(zhuǎn)V2基因的擬南芥呈現(xiàn)開(kāi)花延遲的表型，并且其內(nèi)源表觀沉默位點(diǎn)的甲基化受到干擾。
　　以TYLCV V2蛋白為誘餌，利用酵母雙雜交

4、(Yeast two hybrid，Y2H)系統(tǒng)從本氏煙cDNA文庫(kù)中篩選與V2蛋白互作的寄主因子。將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-V2和本氏煙cDNA文庫(kù)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母Y2HGold，通過(guò)SD/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基篩選，最終確定了NbHDA6為TYLCV V2蛋白的寄主互作因子。同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)NbHDA6基因全長(zhǎng)為1，368 bp，預(yù)測(cè)編碼一個(gè)含456個(gè)氨基酸，分子量約51kD的蛋白;與茸毛煙、番茄、

5、葡萄、川桑、可可及擬南芥編碼的HDA6基因均具有很高的氨基酸同源性。NbHDA6屬于第一類與酵母RPD3蛋白同源的去乙酰化酶，在N端含有一個(gè)保守的組蛋白去乙?；附Y(jié)構(gòu)域;中間含有組蛋白去乙酰化酶必需的活性位點(diǎn);C端則包含甘氨酸富集區(qū)和天冬氨酸富集區(qū)。通過(guò)雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(Bimolecular fluorescence complementation，BiFC)證實(shí)V2和NbHDA6能夠在煙草表皮細(xì)胞中互作，且互作發(fā)生在細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)

6、中。將V2和NbHDA6分別進(jìn)行體外原核表達(dá)和純化，GST pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了兩者在體外的直接互作。
　　利用半定量RT-PCR技術(shù)分析了NbHDA6 mRNA在本氏煙不同組織中的表達(dá)特異性，NbHDA6 mRNA在根中積累量最高，在花中次之，而在葉和莖中的積累量較低;通過(guò)融合GFP的植物瞬時(shí)表達(dá)載體在煙草表皮細(xì)胞中表達(dá)NbHDA6-GFP，明確了NbHDA6定位于細(xì)胞核中。此外，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在擬南芥HDA6突變

7、體axe1-5中轉(zhuǎn)入NbHDA6，發(fā)現(xiàn)其能夠回補(bǔ)axe1-5突變體的遲花表型以及H3、H4的組蛋白高乙?；?，這些結(jié)果表明NbHDA6能夠回補(bǔ)AtHDA6在擬南芥中的組蛋白去乙?；飳W(xué)功能。
　　為了解V2與NbHDA6互作的生物學(xué)意義，以接種TYLCV或PVX-V2和空載體pBinPLUS或PVX的本氏煙葉片總RNA為模板，通過(guò)real time RT-PCR和半定量RT-PCR比較分析了各組植物中NbHDA6 mRNA積累

8、量的差異，結(jié)果證實(shí)不管是接種TYLCV或PVX-V2，NbHDA6 mRNA的積累量都被顯著下調(diào)。利用TRV載體沉默本氏煙中的NbHDA6基因，將野生型和NbHDA6沉默的植株一起進(jìn)行病毒接種實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，與野生型本氏煙相比，TYLCV的侵染效率在NbHDA6下調(diào)表達(dá)的植株中顯著提高，Southern blot檢測(cè)到的病毒積累量明顯高于對(duì)照。亞硫酸氫鹽測(cè)序和甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶PCR實(shí)驗(yàn)表明在NbHDA6下調(diào)表達(dá)的植株中TYLCV

9、病毒的甲基化受到抑制。這些結(jié)果證實(shí)NbHDA6蛋白的積累影響了病毒的侵染，是寄主植物通過(guò)對(duì)病毒基因組的甲基化來(lái)抵御病毒的侵染所必需的。將V2和NbHDA6蛋白分別進(jìn)行體外融合表達(dá)和純化，隨后檢測(cè)V2對(duì)NbHDA6組蛋白去乙?；傅幕钚缘挠绊憽＝Y(jié)果證實(shí)，NbHDA6自身具有較弱的組蛋白去乙酰化酶活性，且活性并不受V2的影響。隨后，我們對(duì)NbMET1的第一個(gè)BAH（Bromo-adjacent homology,與HDA6互作的最小區(qū)域）結(jié)

10、構(gòu)域進(jìn)行體外融合表達(dá)和純化，利用GST pull down實(shí)驗(yàn)證實(shí)NbHDA6與NbMET1在體外的直接互作。最后，利用競(jìng)爭(zhēng)性GST pull down實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著V2蛋白加入量的遞增，被GST-NbHDA6拉下來(lái)的MBP-NbMET1蛋白的量隨之遞減，表明NbMET1和V2能夠競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合NbHDA6。上述結(jié)果表明，TYLCV V2通過(guò)與HDA6互作減少HDA6與MET1的結(jié)合，進(jìn)而喪失對(duì)病毒DNA的甲基化，從而突破植物對(duì)病毒的防御，提