煙粉虱對番茄黃化曲葉病毒的傳毒機(jī)理研究.pdf

1、煙粉虱(Bemisia tabaci)是一種世界性的重大外來入侵性害蟲，危害包括蔬菜、棉花在內(nèi)的600多種寄主植物。20世紀(jì)90年代B型煙粉虱入侵我國并給我國園藝作物帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，2003年在我國云南首次發(fā)現(xiàn)Q型煙粉虱，之后逐漸呈現(xiàn)出進(jìn)一步擴(kuò)張和取代B型煙粉虱的趨勢。近年的研究已經(jīng)證明，Q型煙粉虱已經(jīng)在我國大部分地區(qū)競爭取代了B型煙粉虱而成為當(dāng)?shù)氐闹饕：ι镄?。與此同時(shí)，伴隨著Q型煙粉虱種群的快速擴(kuò)散，由煙粉虱傳播的番茄黃化曲葉病

2、毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus，簡稱TYLCV)導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病毒病在我國從南到北多地發(fā)生并流行蔓延，給我國的番茄生產(chǎn)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，局部地區(qū)甚至整棚絕收。然而關(guān)于煙粉虱傳播番茄黃化曲葉病毒的傳毒機(jī)理以及伴隨B、Q型煙粉虱之間的競爭取代而發(fā)生的番茄黃化曲葉病毒病的大發(fā)生機(jī)制研究尚不清楚。因此，本研究以目前生產(chǎn)上煙粉虱的主要危害生物型B型和Q型煙粉虱為對象，比較了B型和Q型煙粉虱在不同時(shí)間內(nèi)對TY

3、LCV的獲毒能力高低，克隆分析了B型和Q型煙粉虱次生內(nèi)共生菌分泌的傳毒相關(guān)蛋白基因GroEL的蛋白序列，并對該基因進(jìn)行體外的原核表達(dá)等相關(guān)研究，以明確B型和Q型煙粉虱傳播番茄黃化曲葉病毒病的部分機(jī)制，同時(shí)也為煙粉虱及番茄黃化曲葉病毒病的預(yù)防和治理提供理論指導(dǎo)和科學(xué)依據(jù)。主要結(jié)果如下：
　　 ⑴2011年秋季對北京海淀區(qū)、昌平區(qū)及河北廊坊地區(qū)的番茄黃化曲葉病毒病發(fā)病地區(qū)的煙粉虱帶毒率和生物型進(jìn)行了隨機(jī)抽樣檢測，結(jié)果表明：北京海淀區(qū)

4、煙粉虱帶毒率為45％，昌平區(qū)南口為20％，而河北廊坊地區(qū)煙粉虱的帶毒率則高達(dá)100％。所檢測煙粉虱生物型均為Q型，未見B型和其他非B/Q生物型。說明北京及河北局部地區(qū)的B型煙粉虱均被Q型完全取代，田間出現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒病也由Q型煙粉虱傳播，不同地區(qū)發(fā)生程度不一致。
　　 ⑵采用熒光定量PCR技術(shù)比較了B、Q型煙粉虱在不同時(shí)間段捕獲TYLCV能力的差異。結(jié)果表明：在檢測的五個(gè)時(shí)間段內(nèi)(6h-72h)，Q型煙粉虱的病毒捕獲量均顯著

5、高于B型；病毒獲取量達(dá)到飽和的時(shí)間也明顯早于B型，提前了12h。表明Q型煙粉虱無論在獲毒能力還是在獲毒時(shí)間上均顯著強(qiáng)于B型煙粉虱。
　　 ⑶對室內(nèi)飼養(yǎng)的番茄寄主上的B型、Q型煙粉虱次生內(nèi)共生菌編碼的與傳毒相關(guān)的蛋白-GroEL基因分別進(jìn)行了克隆和序列分析。結(jié)果表明：入侵型煙粉虱次生內(nèi)共生菌編碼的GroEL基因是一個(gè)高度保守的基因，全長1668bp，編碼555個(gè)氨基酸。相同寄主上B、Q型煙粉虱次生內(nèi)共生菌GroEL基因的核苷酸序列

6、相似性為99.94％，氨基酸序列的同源性為99.82％。氨基酸序列分析表明，Q型煙粉虱相對于B型僅263位存在一個(gè)氨基酸位點(diǎn)的突變(V→A)。通過熒光定量PCR技術(shù)比較了該基因在兩種生物型煙粉虱體內(nèi)表達(dá)量的差異，結(jié)果表明在兩種生物型內(nèi)，帶毒個(gè)體GroEL基因的表達(dá)量顯著高于未獲毒的煙粉虱個(gè)體，且該基因在Q型煙粉虱體內(nèi)的表達(dá)量是B型獲毒狀態(tài)下為1.66倍，非獲毒狀態(tài)下為1.28倍，且差異顯著(P<0.05)。但兩種生物型之間的蛋白質(zhì)點(diǎn)突變

7、是否會影響該蛋白質(zhì)的空間構(gòu)型進(jìn)而影響B(tài)、Q型煙粉虱在傳毒能力上的差異需要進(jìn)一步研究。
　　 ⑷煙粉虱次生內(nèi)共生菌GroEL基因編碼一種由555個(gè)氨基酸組成、大小為62 kD的蛋白質(zhì)。將該基因全長克隆并與表達(dá)載體Pet30a+連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21-DE3中表達(dá)，經(jīng)過Western blot檢驗(yàn)證實(shí)得到一個(gè)大小為69kD的目的基因融合蛋白，說明B型、Q型煙粉虱的GroEL基因分別在原核表達(dá)載體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了該蛋白的體