內(nèi)生細(xì)菌EBS05的GFP標(biāo)記及其誘導(dǎo)番茄抗中國番茄黃化曲葉病毒的研究.pdf

1、生防細(xì)菌 EBS05是一株樟樹內(nèi)生枯草芽胞桿菌，具有較強(qiáng)的根際定殖能力，且對多種植物病原菌具有穩(wěn)定的拮抗活性，其產(chǎn)生的脂肽類抗生素Surfactin A是誘導(dǎo)煙草抗煙草花葉病毒的有效激發(fā)子，并通過激活SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，顯示出良好的生防應(yīng)用潛力。為了進(jìn)一步明確內(nèi)生細(xì)菌 EBS05的生防機(jī)理，本研究采用綠色熒光蛋白基因標(biāo)記技術(shù)和抗生素標(biāo)記法，研究了菌株 EBS05在番茄根表以及番茄體內(nèi)和根際的定殖動(dòng)態(tài)；以番茄品種江蔬1

2、4號為試驗(yàn)材料，采用RT-PCR和Real time PCR技術(shù)，研究了菌株EBS05對番茄植物的促生作用及其對番茄抗中國番茄黃化曲葉病毒的誘導(dǎo)抗性。結(jié)果如下：
　　1、利用電擊轉(zhuǎn)化法將攜帶質(zhì)粒gfpmut3a基因的穿梭載體pGFP4412導(dǎo)入菌株EBS05，獲得了成功表達(dá)GFP的標(biāo)記菌株EBS05-gfp。菌株EBS05-gfp可有效定殖于番茄根部表面。生物學(xué)特性檢測結(jié)果表明，EBS05-gfp的生長曲線、生物膜形成能力及抗菌活

3、性均與野生菌株一致；EBS05在番茄植株體內(nèi)和根際的定殖動(dòng)態(tài)測定結(jié)果表明，EBS05在番茄根、莖內(nèi)均能有效定殖，其在番茄根和莖內(nèi)的定殖數(shù)量均表現(xiàn)為接種初期逐漸增加，至接種后第14 d達(dá)到最高峰。同時(shí)，菌株EBS05具有較強(qiáng)的根際定殖能力，以菌體濃度為108 cfu/mL的菌懸液灌根處理后2~28 d，菌株EBS05在土壤中的定殖量始終維持在106 cfu/g·FW以上。
　　2、通過盆栽試驗(yàn)，測定了菌株 EBS05對番茄植物的促生

4、作用，并初步探討了其促生機(jī)理。結(jié)果表明，EBS05對番茄植物具有明顯的促生效果。菌株EBS05可誘導(dǎo)番茄體內(nèi)擴(kuò)張蛋白基因 LeEXP2、LeEXP5和LeEXP18的持續(xù)增量表達(dá)，表明 EBS05可能通過誘導(dǎo)擴(kuò)張蛋白基因的增量表達(dá)促進(jìn)番茄植物生長。同時(shí)，EBS05灌根處理后，番茄根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量顯著增加，真菌數(shù)量在處理初期增加，但在處理后期明顯降低，根際土壤脲酶和磷酸酶活性明顯提高，表明 EBS05對番茄的促生作用也可能與其改

5、變根際土壤微生物區(qū)系，提高土壤酶活力有關(guān)。
　　3、內(nèi)生細(xì)菌EBS05能有效誘導(dǎo)番茄對中國番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)抗性。EBS05誘導(dǎo)處理后，番茄黃化曲葉病毒病發(fā)病時(shí)間延遲，病害明顯減輕，誘導(dǎo)抗病性效果達(dá)53.60％。
　　4、運(yùn)用RT-PCR和Real time PCR技術(shù)研究了EBS05對番茄誘導(dǎo)抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。結(jié)果表明，EBS05誘導(dǎo)處理后，番茄體內(nèi)SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游標(biāo)記基因NPR1和PR1均在挑戰(zhàn)接種后第1d被激

6、活，并持續(xù)增量表達(dá)，至第7d時(shí)，其相對表達(dá)量達(dá)到最高峰值，分別比對照增加了16倍和13倍，由此推測，內(nèi)生細(xì)菌EBS05誘導(dǎo)番茄對中國番茄黃化曲葉病毒的系統(tǒng)抗性是通過SA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)的。同時(shí)，在挑戰(zhàn)接種后第5 d，JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的標(biāo)記基因Coi1被激活，且增量表達(dá)，表明在EBS05誘導(dǎo)番茄對中國番茄黃化曲葉病毒系統(tǒng)抗性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑過程中，可能存在SA信號途徑和JA信號途徑的交叉協(xié)同作用。
　　5、采用RT-PCR技術(shù)研究

7、了EBS05對番茄體內(nèi)病程相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)作用。結(jié)果表明， EBS05可誘導(dǎo)番茄體內(nèi)PR1、PR2和PR3基因持續(xù)增量表達(dá)，并有效激活PR5基因的誘導(dǎo)表達(dá)。EBS05誘導(dǎo)處理后，番茄體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性均明顯高于對照，分別于挑戰(zhàn)接種后第7d和第9d達(dá)到活性峰值。
　　6、分別采用比色法和聚丙烯酰胺凝膠電泳法，測定了防衛(wèi)相關(guān)酶活性及其同工酶的變化。結(jié)果表明，EBS05誘導(dǎo)處理后，番茄體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）、多酚

8、氧化酶（PPO）和苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均顯著高于對照健康植株，過氧化物酶（POD）活性在誘導(dǎo)處理后1~5d略有下降，但是從誘導(dǎo)處理后第7d起，活性迅速升高，其活性值始終顯著高于對照，而EBS05誘導(dǎo)處理再挑戰(zhàn)接種后，SOD、POD、PPO和PAL活性活性均明顯高于對照，結(jié)合番茄黃化曲葉病毒病的病程分析，菌株 EBS05誘導(dǎo)處理后番茄植物黃化曲葉病毒病害表現(xiàn)延遲和發(fā)病程度減輕與番茄體內(nèi)防衛(wèi)相關(guān)酶活性的提高有一定的相關(guān)性；EBS05