病毒VdCV1的RNA沉默抑制子研究.pdf

1、棉花黃萎菌病毒Verticillium dahliae chrysovirus1（VdCV1）本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)報(bào)道，但對(duì)該病毒功能及其基因功能尚未做實(shí)驗(yàn)研究。VdCV1是否具有沉默抑制子尚未有研究報(bào)道。探明VdCV1是否具有沉默抑制子對(duì)于探明病毒VdCV1的作用機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)將對(duì)VdCV1所含的4個(gè)基因編碼的蛋白能否抑制植物的RNA沉默進(jìn)行探索。
　　本研究首先以植物表達(dá)載體PH7WG2D為基本骨架，通過(guò)Gateway技術(shù)的

2、BP反應(yīng)構(gòu)建入門(mén)載體，入門(mén)載體與PH7WG2D改造后的表達(dá)載體pJC31通過(guò)LR反應(yīng)構(gòu)建表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)這種方法成功構(gòu)建了表達(dá)RdRP蛋白，CP蛋白及OTU蛋白的植物表達(dá)載體pJCH-VcR1ORF，pJCH-VcR2ORF，pJCD-VcR4ORF，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序分析表明載體構(gòu)建成功另外，通過(guò)酶切連接法，成功構(gòu)建了未知功能蛋白表達(dá)載體pCB301-VCR3ORF。
　　采用農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)法沉默抑制實(shí)驗(yàn)，將pJC

3、H-VcR1ORF、pJCH-VcR2ORF、pJCD-VcR4ORF、pCB301-VCR2ORF質(zhì)粒農(nóng)桿菌分別于pBIGFP農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)注射接種本生煙或轉(zhuǎn)基因本生煙植株16C，并以質(zhì)粒農(nóng)桿菌PJCH-CM、pCB301處理為陰性對(duì)照。
　　實(shí)驗(yàn)中紫外燈下綠色熒光觀察結(jié)果顯示：VcR1、VcR2基因處理組在第3、4天時(shí)比陰性對(duì)照組的綠色熒光強(qiáng)，第5天熒光差異明顯減??；p19陽(yáng)性對(duì)照組的熒光亮度全過(guò)程比VcR1、VcR2基因處理組

4、的熒光亮度強(qiáng)且持續(xù)穩(wěn)定。Western blot分析GFP蛋白表達(dá)的時(shí)序過(guò)程，結(jié)果顯示：在第3、4天，VcR1、VcR2基因處理組比陰性對(duì)照組GFP蛋白表達(dá)量大，第5天GFP表達(dá)量差異明顯減小。Northern blot分析目的基因表達(dá)時(shí)序過(guò)程，結(jié)果顯示：VcR1、VcR2基因在植物中瞬時(shí)表達(dá)量在第3、4天表達(dá)量相對(duì)較大，第5天明顯減少。因此綜合分析認(rèn)為VdCV1的VcR1基因編碼的RdRP蛋白和VcR2基因編碼的CP蛋白可能是植物RN