煙草脈帶花葉病毒和馬鈴薯A病毒HC-Pro調(diào)控RNA沉默抑制、協(xié)生和致病力的機(jī)制.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬病毒編碼的輔助成分-蛋白酶(Helpercomponent-proteinase，HC-Pro)是一種多功能蛋白，參與病毒的蚜傳、癥狀表達(dá)、基因組復(fù)制、移動(dòng)、抑制RNA沉默，以及與其他屬病毒的協(xié)生等過(guò)程。本文利用不同體系分析了煙草脈帶花葉病毒(Tobaccoveinbandingmosaicvirus，TVBMV)和馬鈴薯A病毒(PotatovirusA，PVA)HC-Pro不同突變對(duì)RNA沉默抑制、協(xié)生活性和致病力的影響

2、，明確馬鈴薯Y病毒屬病毒HC-Pro調(diào)控這些過(guò)程的機(jī)制，為利用弱毒株系防治TVBMV提供物質(zhì)基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。本研究主要研究結(jié)果如下：
　　 構(gòu)建了包含pCaGFP、pCahpGFP和pCaHC(含有TVBMVHC-Pro基因)三個(gè)載體的RNA沉默抑制瞬時(shí)表達(dá)分析體系，并利用此體系比較了TVBMVHC-Pro野生型和18個(gè)突變體的抑制RNA沉默活性，這些突變體抑制RNA沉默的活性分為四類：(1)5個(gè)突變體抑制RNA沉默活性升高；(

3、2)5個(gè)突變體抑制RNA沉默活性不變；(3)2個(gè)突變體抑制RNA沉默活性降低；(4)6個(gè)突變體喪失了抑制RNA沉默活性。用抑制RNA沉默活性強(qiáng)的突變體浸潤(rùn)本氏煙葉片中GFP蛋白的表達(dá)量更大，而用抑制RNA沉默活性喪失的突變體浸潤(rùn)的本氏煙葉片中檢測(cè)不到GFP蛋白的表達(dá)。
　　 利用pAGFP、pAhpGFP和pAHC(含有PVAHC-Pro基因)三個(gè)載體構(gòu)成的瞬時(shí)農(nóng)達(dá)體系研究了PVAHC-Pro突變對(duì)其抑制RNA沉默活性的影響。結(jié)

4、果表明，9個(gè)突變休的抑制RNA沉默活性降低，另外9個(gè)突變體喪失了抑制RNA沉默活性。相同的突變對(duì)TVBMV和PVA兩種病毒HC-Pro抑制RNA沉默活性的影響不同，如TVBMVHC-Pro突變體D198A抑制RNA沉默活性降低，而PVAHC-Pro相同突變體喪失了抑制RNA沉默活性。第6位保守氨基酸F缺失后，PVAHC-Pro抑制RNA沉默活性降低，面TVBMVHC-Pro抑制RNA沉默活性喪失。
　　 攜帶野生型HC-Pro的

5、馬鈴薯X病毒(PotatovirusX，PVX)侵染性克隆接種本氏煙后引起植株的系統(tǒng)壞死。利用PVX載體研究了TVBMV和PVAHC-Pro突變對(duì)協(xié)生作用的影響。TVBMVHC-Pro的6個(gè)突變體在本氏煙上不引起壞死癥狀，另外12個(gè)突變體與野生型HC-Pro一樣在本氏煙上引起壞死癥狀。TVBMVHC-Pro喪失抑制RNA沉默活性的突變都同時(shí)喪失了協(xié)生作用，表明TVBMVHC-Pro這兩種功能間具有相關(guān)性。PVAHC-Pro的11個(gè)突變體

6、失去了協(xié)生功能，其中9個(gè)突變體喪失了抑制RNA沉默活性，2個(gè)突變體抑制RNA沉默活性降低。
　　 利用攜帶GFP的TVBMV侵染性克隆pCaTVBMV-GFP測(cè)定了HC-Pro17個(gè)突變對(duì)TVBMV致病力的影響。野生型pCaTVBMV-GFP在本氏煙上能夠引起脈明、花葉、畸形和植株矮化等癥狀，在紫外燈下表現(xiàn)出明顯的綠色熒光。突變體EITC、AGS和SQN表現(xiàn)脈明及葉片畸形癥狀，與野生型TVBMV癥狀一致，說(shuō)明這些位點(diǎn)的突變對(duì)病毒

7、的致病力無(wú)影響。突變體PAK、D198Y、D198F和D198G在接種后第8天癥狀表現(xiàn)輕微的脈明，但后期癥狀與野生型病毒相似，說(shuō)明這些位點(diǎn)的突變延遲了癥狀的產(chǎn)生。突變體APS、D198H、D198R、D198K、FINK、F6Del、D198A、DEN、IQI和ART接種的植株初期僅表現(xiàn)脈明癥狀。紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)，癥狀明顯的植株都表現(xiàn)出較明顯的綠色熒光，而癥狀變輕的突變體中，D198R初期熒光強(qiáng)度與野生型病毒一致，其余突變體侵染植株均表