煙草脈帶花葉病毒CP基因的原核表達及免疫金標試紙條的研制.pdf

1、煙草脈帶花葉病毒病是由馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)的煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)引起的，在我國很多主產煙區(qū)均有發(fā)生，并且涉及范圍和危害程度呈上升趨勢。對該病害進行準確及時的診斷是有效控制其發(fā)生的重要前提。除TVBMV外，自然侵染煙草的馬鈴薯Y病毒屬的馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y.PVY)和煙草脈斑駁病毒(Tobacco vein mottling

2、 virus，TVMV)等也能引起脈帶癥狀，加上煙草病毒病復合侵染現(xiàn)象嚴重，根據(jù)癥狀很難將TVBMV與它們區(qū)分。利用血清學和分子生物學等檢測手段雖然能準確診斷，但操作復雜，需要專門的實驗儀器。為建立一種快速、特異、簡便的檢測煙草脈帶花葉病毒的方法，本文研制了TVBMV快速檢測試紙條，研究結果如下： 利用RT-PCR方法獲得了煙草脈帶花葉病毒(TVBMV)陜西分離物的外殼蛋白(CP)基因。序列分析表明，TVBMV陜西分離物的CP基

3、因全長為816 bp，與GeneBank中己報道的9個國內外分離物相比，核苷酸和氨基酸序列同源性分別為90.28％-98.15％和97.05％-100％，與山東蒙陰分離物關系最近。 將TVBMV CP基因克隆到pMD18-T Simple Vector，經BamH I/Not I雙酶切得到目的片段，定向插入到pET30a載體中，構建了原核表達載體pET30-TVBMV CP，并轉化大腸桿菌BL21，用IPTG進行誘導表達。以表達

4、產物為抗原免疫家兔制備了特異性抗血清。在大腸桿菌中tVBMV CP獲得了高效表達，分子量約為37 kD，ELISA法測定抗血清效價為1/6400。Western-blot檢測結果表明，制備的抗血清可用于檢測發(fā)病植株。 應用膠體金標記技術和免疫層析原理，在玻璃纖維膜、硝酸纖維膜的檢測帶和質控帶上分別噴上膠體金與煙草脈帶花葉病毒兔多克隆抗體的偶聯(lián)物、煙草脈帶花葉病毒兔多克隆抗體和羊抗兔IgG，研制出煙草脈帶花葉病毒快速檢測試紙條。病