煙草脈帶花葉病毒和馬鈴薯X病毒的協生作用及二者侵染本氏煙的轉錄組學分析.pdf

1、馬鈴薯Y病毒屬成員與馬鈴薯X病毒（Potato virus X, PVX）在生產中常常復合侵染植株產生協生作用，引起更為嚴重的癥狀。煙草脈帶花葉病毒（Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV）是馬鈴薯Y病毒屬的一個確定種，能夠自然侵染煙草、馬鈴薯、番茄等茄科作物，在生產中的危害逐年加重。隨著高通量測序技術的應用，利用轉錄組測序技術對植物轉錄本分析的研究逐漸成為熱點，但是應用于研究病毒協生作用的分子機

2、制方面的報道還很少。本研究以實驗室自主構建的攜帶GFP的TVBMV侵染性克隆、將HC-Pro的CDN基序中D198突變?yōu)镵并將中間區(qū)域的IGN突變?yōu)镈EN而失去協生能力的弱毒突變體以及PVX侵染性克隆為基礎，研究TVBMV與PVX的協生作用，并利用RNA-Seq技術研究TVBMV野生型及弱毒突變體分別與PVX復合侵染本氏煙過程中差異表達的寄主基因，研究馬鈴薯Y病毒屬病毒與PVX協生作用影響的寄主代謝通路；利用小RNA測序技術鑒定侵染芝麻

3、的病毒種類，克隆獲得1個TVBMV芝麻分離物的全基因組序列并分析了其分子變異情況。具體結果如下：
　　從病害癥狀、病毒含量等方面研究了TVBMV與PVX的協生。本氏煙接種PVX后第10天，系統(tǒng)葉片表現花葉癥狀；TVBMV與PVX共同接種本氏煙，在系統(tǒng)葉片引起花葉及卷曲癥狀，導致植株生長遲緩；弱毒突變體與PVX共同接種本氏煙，僅在植株上部葉片引起輕微的花葉癥狀。TVBMV與PVX共同接種后第14天，本氏煙植株出現矮化和壞死，弱毒突變

4、體與PVX復合侵染僅引起與PVX相同的花葉癥狀。共同接種本氏煙后第20天，TVBMV與PVX協生加重了病害癥狀、顯著抑制煙草植株的生長，并造成了植株頂部葉片的壞死，而無協生作用的弱毒突變體與PVX復合侵染僅造成了與PVX單獨侵染相似的花葉癥狀。ELISA檢測結果表明，TVBMV與PVX復合侵染在接種后第6天TVBMV病毒積累量開始明顯升高，并且與單獨接種TVBMV的本氏煙中病毒積累量相當；弱毒突變體與PVX復合侵染后TVBMV病毒積累量

5、遠低于野生型TVBMV與PVX復合侵染的本氏煙，且病毒積累量一直維持在較低水平。
　　利用RNA-Seq技術研究了TVBMV野生型及弱毒突變體分別與PVX復合侵染過程中本氏煙的轉錄組變化情況。病毒在接種后第2天大量復制，接種后第2天的接種葉片及第10天的系統(tǒng)葉片中均含有大量的病毒RNA，clean reads能比到本氏煙參考基因組上的較少。GO富集分析顯示，TVBMV與PVX的復合侵染導致大量寄主基因發(fā)生異常表達，干擾了寄主的正常

6、代謝，影響了寄主蛋白和酶代謝相關基因、DNA復制相關基因、光合作用相關基因等，使寄主產生一系列的細胞組分、生物過程、分子功能的改變。與弱毒突變體與PVX的侵染相比，侵染前期TVBMV與PVX協生影響DNA復制通路17個基因上調表達，系統(tǒng)侵染后造成與細胞壁合成相關的33個基因和與光合作用相關的蛋白復合體及外周天線61個基因的下調表達以及RNA沉默途徑DCL2和RDR1基因的上調表達。KEGG分析表明，與弱毒突變體與PVX的侵染相比，TVB

7、MV與PVX協生，誘導核糖體合成相關基因的表達以幫助病毒蛋白合成；之后通過抑制光合作用相關代謝通路，抑制細胞壁合成相關酶的代謝通路，調節(jié)激素介導的信號轉導通路，引起植株的花葉和壞死。同時，植物的SA信號途徑受到誘導，產生大量PR蛋白以防御病毒的侵染。
　　將從濟南章丘芝麻田中采集的表現黃綠花葉、細葉及皺縮的芝麻病株葉片進行小RNA測序，檢測到西瓜花葉病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、菜豆普通花葉病毒（

8、Bean common mosaic virus，BCMV）和煙草脈帶花葉病毒（TVBMV）等三種馬鈴薯Y病毒屬病毒，其中TVBMV能夠自然侵染芝麻系首次報道，也是TVBMV能夠侵染除茄科以外作物的首次報道。
　　進一步RT-PCR及血清學檢測證實了小RNA的測序結果。利用步移擴增和5' RACE方法獲得了TVBMV-Zhangqiu分離物的全基因組序列，其全基因組序列為9596個核苷酸。TVBMV-Zhangqiu分離物與山東沂

9、源的YY分離物（JN630472）的核苷酸及氨基酸一致率最高，分別為97.89％和99.06%；系統(tǒng)進化分析表明，TVBMV-Zhangqiu分離物聚類到來源于中國大陸的MC組；重組分析表明TVBMV-Zhangqiu分離物是SDYS1與YN分離物的潛在重組體，屬于MC組的組內重組，其基因組的主要親本是SDYS1，8642 nt-9533 nt來源于YN；TVBMV-Zhangqiu與TVBMV-HN39接種芝麻的癥狀存在差異， Zha