煙草脈帶花葉病毒侵染性克隆的構(gòu)建及其在交叉保護、外源蛋白表達及VIGS中的應用.pdf

1、植物病毒侵染性cDNA克隆是研究病毒致病機理的重要工具。獲得了侵染性cDNA克隆，可利用反向遺傳學方法分析病毒基因在病毒復制、局部和系統(tǒng)移動、癥狀發(fā)展及病毒與寄主因子互作等過程中的作用，進而可以獲得弱毒株系用來保護植物免受強毒株系的危害。植物病毒侵染性cDNA克隆也可以改造為超表達載體和病毒介導的基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)載體，可用來生產(chǎn)醫(yī)用、獸用疫苗和抗體，也可用來研究植物基因功能。

2、
　　 煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)屬于馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，可以由蚜蟲以非持久性方式傳播傳播。近幾年來，TVBMV在我國煙草上的發(fā)生呈上升趨勢，給煙葉生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。本研究獲得了TVBMV侵染性cDNA克隆，驗證了TVBMV弱毒突變體的交叉保護效果，并將TVBMV侵染性克隆改造為植物病毒超表達和VIGS載體。主要具體結(jié)果如下：

3、　　 (1)利用經(jīng)典5'RACE獲得了TVBMV HN39分離物的全長5'-UTR。TVBMV HN39的5'-UTR由171個核苷酸(nt)組成，包含多數(shù)馬鈴薯Y病毒屬病毒包含的高度保守序列區(qū)域boxA(ACAACAU)和boxB(UCAAGCA)，比以前測定的多了25個nt。
　　 (2)構(gòu)建了能分別用基因槍和農(nóng)桿菌浸潤接種的TVBMV侵染性克隆。在TVBMVHN39分離物的P3基因3’端、CI基因的5'端和3’端分別插入

4、一個內(nèi)含子，將其克隆到插入了35S啟動子的pUC19載體上，獲得質(zhì)粒pTVBMV。利用基因槍將pTVBMV接種本氏煙(Nicotiana benthamiana)、三生煙(N.tabacum cv.Samsun)和亮黃煙(N.rustica)，發(fā)病率為100％，說明pTVBMV有非常高的侵染性；pTVBMV在這三種寄主上的癥狀和病毒積累量均與野生型TVBMV一致。將攜帶內(nèi)含子的TVBMV基因組克隆到質(zhì)粒pCambia0390的SalⅠ和

5、SmaⅠ之間，獲得了能利用農(nóng)桿菌浸潤的侵染性克隆pCamTVBMV。通過融合PCR在TVBMVNIb和CP基因之間插入了GFP基因，得到pCamTVBMV-GFP；利用pCamTVBMV-GFP可在紫外燈下觀察病毒在本氏煙中的移動。
　　 (3)利用TVBMV侵染性克隆pCamTVBMV-GFP分析了HC-Pro調(diào)控病毒致病力、抑制RNA沉默活性和協(xié)生的關(guān)鍵氨基酸位點。突變體IQI(IQC-IQI)、ART(NRT-ART)、R

6、182I(FRNK-FINK)、D198K(CDN-CKN)和DEN(IQN-DEN)在本氏煙上的癥狀明顯減輕，ELISA檢測不到病毒的存在但熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果為陽性，說明該位點的突變影響了病毒的致病力、復制和翻譯水平；突變體PAK(PTK-PAK)和APS(NPS-APS)引起的癥狀和野生型病毒一致，但癥狀出現(xiàn)的時間比野生型病毒的晚2天；而突變體EITC(RITC-EITC)、AGS(NGS-AGS)和SQN(IQN-SQN

7、)對TVBMV的癥狀無影響，接種這三個突變體的本氏煙植株中病毒積累量與野生型病毒一致。農(nóng)桿菌共浸潤實驗和協(xié)生實驗表明，顯著降低病毒致病力的5個突變位點基本喪失了RNA沉默抑制活性及與PVX的協(xié)生作用。這說明TVBMVHC-Pro的這些位點同時參與調(diào)控病毒的致病力、協(xié)生和抑制RNA沉默活性。
　　 (4)測定了含有單位點、雙位點和三個位點突變的弱毒突變體的交叉保護效果，證明間隔期10天以上交叉保護效果更好。在本氏煙上，單個位點突變

8、體DEN表現(xiàn)為輕微的花葉癥狀；雙位點突變體DEN+D198K引起輕微的脈明癥狀；而三位點突變體DEN+D198K+ART無明顯癥狀。交叉保護實驗表明，接種雙位點突變體DEN+D198K10天以后進行挑戰(zhàn)接種交叉保護效果最好。
　　 (5)構(gòu)建了TVBMV的超表達載體和VIGS載體。在pCamTVBMV衣殼蛋白(Coat protein，CP)基因上游和下游分別插入多克隆位點(MCS-1和MCS-2)，疫霉菌的Elicitin基因