高沉默效率植物病毒雙鏈RNA的抗病毒研究.pdf

1、RNA沉默是生物(特別是真核生物)細(xì)胞抵御外來核酸(病毒、轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)基因)入侵以保持生物自身基因組完整性的一種防御機(jī)制。dsRNA為誘發(fā)RNA沉默的關(guān)鍵因子。利用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建病毒基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(hairpin RNA)(轉(zhuǎn)錄后均形成dsRNA)的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化植物，獲取抗病毒轉(zhuǎn)基因植物是利用基因工程技術(shù)控制植物病毒病害的最有效策略，這一策略通常稱為RNA介導(dǎo)的病毒抗性(RNA-mediated virus resist

2、ance)。RNA介導(dǎo)的病毒抗性具有抗性強(qiáng)、抗性持久、生物安全性高等特點(diǎn)。盡管如此，但由于公眾出于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)和食品安全性的考慮，抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用仍然受到極大地限制。新近的研究表明，通過細(xì)菌原核表達(dá)dsRNA同樣能夠干擾植物病毒的侵染。與獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因植物相比，利用細(xì)菌表達(dá)病原dsRNA沉默病毒基因的表達(dá)具有更高的生物安全，更易被接受。
　　 煙草病毒病是全世界煙草栽培區(qū)發(fā)生普遍、危害嚴(yán)重的一大類病害。其中分布

3、廣、危害嚴(yán)重的有馬鈴薯Y病毒(PVY)、煙草花葉病毒(TMV)等。在田間，病毒病多混合發(fā)生，給煙草生產(chǎn)帶來巨大損失。病害流行的年份，由病毒病造成的煙葉產(chǎn)量損失可達(dá)30％～50％，個(gè)別地塊甚至絕產(chǎn)。本研究以PVY和TMV的部分功能基因的熱點(diǎn)位置為靶序列構(gòu)建hpRNA載體，利用原核表達(dá)dsRNA的策略，比較PVY不同功能基因及同一功能基因的不同區(qū)段的抗病效果，并探討利用該策略同時(shí)抗兩種病毒的基因投遞方式對(duì)抗病效果的影響進(jìn)行，為利用該策略抗植

4、物病毒的研究提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 (1)原核表達(dá)馬鈴薯Y病毒基因組不同功能基因的雙鏈RNA抗病毒研究
　　 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增PVY外殼蛋白基因(Coat Protein，CP)、復(fù)制酶基因(Nuclear Inclusion Protein b，NIb)和輔助蛋白(Helper Component Protein，HC-Pro)基因中間區(qū)域長(zhǎng)度為600bp的cDNA片段，構(gòu)建發(fā)夾RNA(hpR

5、NA)結(jié)構(gòu)的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入M-JM1091acY菌株中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，均可表達(dá)600bp的dsRNA，證明所構(gòu)建的dsRNA表達(dá)載體正確。
　　 用原核表達(dá)PVY外殼蛋白基因、復(fù)制酶基因和輔助蛋白基因的dsRNA處理煙草植株，進(jìn)行抗病性鑒定。檢測(cè)結(jié)果顯示，原核表達(dá)PVY病毒不同功能基因的dsRNA均能保護(hù)植物抵抗PVY病毒的侵染，但介導(dǎo)的抗病性存在著差異。其中來源于復(fù)制酶基因的dsRNA介導(dǎo)的抗病效果最好，72％左右的處理

6、植株表現(xiàn)為抗??；來源于衣殼蛋白基因的dsRNA介導(dǎo)的抗病效果較好，56％的處理植株表現(xiàn)為抗??；而來源于蚜傳輔助蛋白基因的dsRNA介導(dǎo)的抗病效果較差，表現(xiàn)為抗病植株占處理植株的比例為46％。
　　 (2)原核表達(dá)馬鈴薯Y病毒NIb基因的不同區(qū)段的雙鏈RNA抗病毒研究
　　 根據(jù)已克隆的馬鈴薯Y病毒壞死株系(PVYN)的復(fù)制酶(NIb)基因序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR擴(kuò)增NIb基因的5’端、中間、3’端各500bp cDNA區(qū)

7、段，分別反向插入原核表達(dá)載體pGEM-GUS中，構(gòu)建了3個(gè)hpRNA結(jié)構(gòu)的原核表達(dá)載體pGEMNIb-1、pGEMNIb-2和pGEMNIb-3。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，在大腸桿菌M-JM1091acY菌株中可表達(dá)產(chǎn)生500bp的核酸片段，經(jīng)DNase和RNaseA消化處理，證實(shí)為dsRNA。
　　 提取表達(dá)的PVYNIb基因不同區(qū)段的dsRNA處理煙草，進(jìn)行抗病毒試驗(yàn)，結(jié)果顯示，表達(dá)NIb基因不同區(qū)段的dsRNA均能保護(hù)植物抵抗病毒的

8、侵染，但區(qū)段間存在顯著差異，中間區(qū)段效果最好，抗性植株的比例為66％；3’端次之，抗性植株的比例為52％；5’端區(qū)段效果最差，抗性植株的比例僅為34％。Northernblot分析結(jié)果表明：目的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累量與植株的抗病性呈負(fù)相關(guān)，證明所獲得的抗病性是RNA介導(dǎo)的，21～25nt的siRNAs是RNA沉默的效應(yīng)分子。
　　 (3)原核表達(dá)PVY、TMV的dsRNA多抗病毒研究
　　 基于前期研究結(jié)果，選取了抗病效果

9、較好的PVY的CP和NIb，TMV的CP和MP基因熱點(diǎn)位置序列，構(gòu)建了包含PVY、TMV的單病毒cDNA區(qū)段及2種病毒嵌合基因cDNA區(qū)段的6個(gè)hpRNA載體，IPTG誘導(dǎo)目的dsRNA表達(dá)，比較單病毒dsRNA的混合物和病毒嵌合基因的dsRNA的抗病效果。結(jié)果顯示：兩種原核表達(dá)的dRNA投遞策略均能夠同時(shí)介導(dǎo)對(duì)PVY、TMV兩種病毒的抗性，但單病毒dsRNA的混合物較兩種病毒嵌合基因的dsRNA具有更好地保護(hù)效果，最佳組合抗病效果為4