小麥矮縮病毒(WDV)的致病因子及RNA沉默抑制子的鑒定.pdf

1、小麥矮縮病毒（Wheat dwarf virus，WDV）是雙生病毒科玉米線條病毒屬的成員，由條沙葉蟬(Psammotettix striatus)傳播危害。該病于2007年在我國(guó)陜西韓城大面積爆發(fā)，目前已在我國(guó)小麥產(chǎn)區(qū)造成嚴(yán)重危害。為了探明WDV的致病機(jī)理，本論文鑒定了WDV編碼的致病因子并初步解析了其作用機(jī)制。
　　 本研究分別克隆了WDV的V1、V2、RepA和Rep四個(gè)基因，將其構(gòu)建到PVX表達(dá)載體PGR106上，利用農(nóng)

2、桿菌浸潤(rùn)法接種本氏煙后，癥狀觀察顯示只有含有Rep的PVX重組表達(dá)載體(PVX-Rep)在本氏煙接種葉誘導(dǎo)葉片出現(xiàn)黃化、皺縮和壞死斑，接種后期出現(xiàn)系統(tǒng)壞死和植株矮化癥狀。進(jìn)一步對(duì)Rep進(jìn)行無(wú)義突變并構(gòu)建重組表達(dá)PVX-RepUT，浸潤(rùn)接種本氏煙后只能誘導(dǎo)接種葉和系統(tǒng)葉片出現(xiàn)花葉癥狀。ELISA和Western blot分析表明，PVX-Rep浸潤(rùn)接種9天、12天和15天后本氏煙葉片中PVX的病毒含量相比浸潤(rùn)PGR106空載體對(duì)照和PVX

3、-RepUT的葉片明顯降低，表明在本氏煙上引起的嚴(yán)重壞死是由Rep蛋白表達(dá)導(dǎo)致的。對(duì)Rep基因的突變分析表明，Rep蛋白的N端是致病的關(guān)鍵區(qū)，而Rep蛋白的C端對(duì)于致病性的影響并非關(guān)鍵。
　　 利用農(nóng)桿菌共浸潤(rùn)轉(zhuǎn)GFP基因的16c本氏煙，發(fā)現(xiàn)WDV編碼的4個(gè)蛋白中只有Rep能抑制GFP基因誘導(dǎo)的局部沉默，浸潤(rùn)3天后在紫外燈下觀察發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)區(qū)有明顯的綠色熒光，Northern blot分析證實(shí)Rep和GFP共浸潤(rùn)轉(zhuǎn)GFP基因本氏煙3

4、天后GFP mRNA的積累量明顯增加，表明WDV編碼的Rep蛋白是RNA沉默的抑制子。進(jìn)一步利用農(nóng)桿菌浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Rep能抑制GFP基因系統(tǒng)沉默信號(hào)的傳導(dǎo)，還具有抑制GFP16c本氏煙GFP基因系統(tǒng)沉默的功能。對(duì)Rep突變體的分析發(fā)現(xiàn)，Rep蛋白的N端和C端都不是抑制基因沉默所必需的。進(jìn)一步的電泳遷移率變動(dòng)試驗(yàn)(EMSA)表明，Rep蛋白能與21nt和24 nt的單、雙鏈siRNA結(jié)合，且結(jié)合能力隨著蛋白濃度的增加而增強(qiáng)，但結(jié)合單鏈si