南方水稻黑條矮縮病毒非結構蛋白P6是病毒復制的關鍵因子.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）由介體白背飛虱傳播，不經(jīng)卵傳播。SRBSDV編碼的非結構蛋白P5-1、P6和P9-1是病毒復制和裝配的場所—病毒原質（viroplasm）的組分。這三種非結構蛋白在病毒的復制過程中扮演著至關重要的作用。已知P6能分別與P5-1和P9-1互作，而P5-1和P9-1不能互作，那么這三種非結構蛋白在病毒原質的形成過程中是否由某一個蛋白起著決定性的作用，需要我們深入的研究。
　　本實驗首先通過免疫熒光標

2、記技術在介體白背飛虱培養(yǎng)細胞中觀察SRBSDV侵染后P5-1、P6和P9-1表達的先后順序，結果發(fā)現(xiàn)當SRBSDV侵染18 h時，P9-1沒有表達，P6的表達量稍多于P5-1，且以顆粒狀形態(tài)分布在細胞質周圍；36 h時，P5-1和P6都大量表達，而此時P9-1也開始少量表達；隨著侵染時間的延長，P5-1，P6和P9-1的表達量都顯著升高；72 h時，三種非結構蛋白均勻分布在細胞質中。所以這三種蛋白表達的先后順序為P6, P5-1和P9-

3、1。
　　其次，利用RNAi（RNA interference）干擾和免疫熒光標記技術研究發(fā)現(xiàn)，分別干擾P5-1、P6和P9-1在白背飛虱培養(yǎng)細胞中的表達，均導致SRBSDV的侵染率顯著降低。同時，抑制P5-1表達后， P5-1和P9-1的表達量明顯降低，但是P6的表達量和對照組相當；抑制P6表達后，P5-1、P6和P9-1的表達量都顯著降低；抑制P9-1表達后，除了自身蛋白的表達量降低外，另外兩個蛋白的表達水平不受影響。dsRN

4、As降低了目標蛋白的轉錄和表達水平，并且干擾P6的表達對病毒復制的影響最大。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot的實驗結果也進一步證實了這一結論。
　　最后，構建目的基因N端融合e-GFP或mCherry的重組桿狀病毒表達載體，當 SRBSDV P5-1-eGFP、P6-mCherry和P9-1-mCherry在Sf9細胞中單獨表達時，P5-1-eGFP彌散分布在細胞質周圍，P6-mCherry和P9-1

5、-mCherry都以顆粒狀分布在細胞質內。當三種蛋白兩兩組合共同侵染時， P6-mCherry與P5-1-eGFP和P9-1-eGFP都會共定位，形成顆粒狀的病毒原質，而這和實驗室構建的桿狀病毒表達載體Bacmid-SRBSDV-P5-1、P6和P9-1侵染Sf9細胞的結果是一致的。這一結果也進一步說明P6在SRBSDV病毒原質的形成過程中起到了其他蛋白無法代替的作用。
　　綜合以上結果，本實驗在細胞水平，通過觀察三種非結構蛋白在

6、介體細胞中的表達順序，明確當SRBSDV侵染介體白背飛虱細胞后，P6最早表達，可能起重要的調控作用。借助于dsRNA誘導的RNAi、RT-qPCR和Western blot等技術手段證實了P6是病毒復制增殖過程中最關鍵的因子，啟動病毒原質的形成，P6能夠招募P5-1和P9-1一起形成病毒原質，P5-1和P9-1在病毒原質中參與病毒基因組的復制和病毒粒體的裝配。因此，通過對P6的深入研究，有助于我們利用靶標基因找到防治水稻病毒病的方法，為