南方水稻黑條矮縮病毒分子檢測方法的研究.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)為呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fiifivirus）第2組的一個建議新種。主要由白背飛虱Sogatella furcifera)以持久性不經(jīng)卵方式傳播，侵染水稻、玉米等引起南方水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病。疑似病株的田間診斷及白背飛虱帶毒率測定是病害流行預(yù)測的重要因子。當(dāng)前常用的方法，如生物學(xué)方法、免疫

2、學(xué)方法、分子生物學(xué)方法，存在耗時長、操作復(fù)雜及成本高等缺陷，難以滿足快速、準(zhǔn)確、低成本的檢測要求，也不能實現(xiàn)病毒RNA拷貝數(shù)的定量。另外，感染SRBSDV的水稻植株與水稻黑條矮縮病表現(xiàn)類似癥狀，且在基因組序列、病毒粒體形態(tài)、癥狀、寄主范圍、傳毒介體及血清學(xué)等方面也非常相似，傳統(tǒng)檢測方法很難將它們區(qū)分。有必要建立適用于不同要求和場所的檢測方法來滿足實際需求。
　　 為了滿足快速、簡便、低成本、高特異的要求，本研究建立了逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)

3、等溫擴增方法（RT-LAMP）。針對SRBSDV S9核苷酸序列保守區(qū)域設(shè)計4條LAMP特異性引物（F3，B3，F(xiàn)IP, BIP），從引物濃度、MgSO4濃度及反應(yīng)溫度、時間幾個方面對RT-LAMP方法進行優(yōu)化。確定引物濃度比為1∶8（F3/B3終濃度0.2μM，F(xiàn)IP/BIP終濃度1.6μM），MgSO4終濃度8mM，60-62℃恒溫反應(yīng)60 min為適宜實驗條件。本RT-LAMP方法的靈敏性是RT-PCR方法的10倍，能夠排除RBS

4、DV的干擾而特異的檢測SRBSDV，適合寄主植物和介體體內(nèi)SRBSDV的快速檢測。
　　 為了實現(xiàn)病毒RNA拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量，本研究建立了Real time RT-PCR檢測方法。根據(jù)SRBSDV S9核苷酸序列的保守區(qū)域設(shè)計2條特異性引物(SRBSDV-S9-F和SRBSDV-S9-R)。制備重組質(zhì)粒pGEM-T easy-S9，通過體外轉(zhuǎn)錄與純化制備RNA標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)化引物濃度、退火-延伸溫度，確定引物終濃度為300 nM，退

5、火-延伸溫度60.0℃。體外轉(zhuǎn)錄獲得的RNA標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)10倍系列梯度稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，進一步測定擴增產(chǎn)物的溶解溫度獲得熔點曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.996，擴增效率為100.2％，熔點曲線峰單一尖銳，說明擴增產(chǎn)物單一，特異性強。靈敏性測驗發(fā)現(xiàn)該方法靈敏性高，比常規(guī)RT-PCR方法高100倍，可實際應(yīng)用于病毒拷貝數(shù)的準(zhǔn)確定量，為SRBSDV的致病機制、分子生物學(xué)研究等奠定了基礎(chǔ)。
　　 為評價SRBSDV幾種檢測方法的適用范圍，本