南方水稻黑條矮縮病毒P10與介體白背飛虱互作蛋白的分析和鑒定.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV)最早于2001年在中國(guó)廣東省陽(yáng)江市發(fā)現(xiàn)。SRBSDV是呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）的成員，其引起的南方水稻黑條矮縮病可導(dǎo)致水稻生產(chǎn)的嚴(yán)重減產(chǎn)。該病毒通過(guò)白背飛虱(WBPH, Sogatella furcifera Horvath, Hemiptera: Delphacidae)以持

2、久增殖型方式進(jìn)行傳播。在過(guò)去的幾年內(nèi)，借助白背飛虱的遷移，SRBSDV已經(jīng)迅速蔓延至中國(guó)南部、越南北部、日本和泰國(guó)，成為亞洲東南部和東部最重要的水稻病毒病之一。白背飛虱可借助風(fēng)力進(jìn)行長(zhǎng)距離遷移，因此其在亞洲大部分國(guó)家均有分布，包括中國(guó)、巴基斯坦、日本、韓國(guó)、沙特阿拉伯、泰國(guó)、印度、印度尼西亞、斐濟(jì)、孟加拉國(guó)和塞舌爾。帶毒白背飛虱的遷移分散可導(dǎo)致SRBSDV的二次侵染，進(jìn)而造成南方水稻黑條矮縮病的爆發(fā)。
　　病毒通過(guò)與介體昆蟲之間的

3、特異性互作來(lái)完成其有效的傳播，這種互作可以幫助病毒在昆蟲體內(nèi)各個(gè)組織間運(yùn)輸，并能克服昆蟲各種免疫反應(yīng)。目前針對(duì)病毒在介體內(nèi)侵染、移動(dòng)和復(fù)制過(guò)程的分子機(jī)理和涉及的互作蛋白的研究較少，因此，為解析介體昆蟲的傳毒機(jī)制則必須明確和鑒定與病毒互作的介體昆蟲蛋白。在本研究中，我們利用了酵母雙雜交技術(shù)，以 SRBSDV的外殼蛋白P10為誘餌，篩選了介體白背飛虱的cDNA文庫(kù)，共獲得了130個(gè)互作的白背飛虱蛋白。根據(jù)基因注釋（GO）對(duì)這130種互作蛋白

4、進(jìn)行了分類，其中依據(jù)分子功能可分為12類，依據(jù)生物學(xué)過(guò)程可分為9類，依據(jù)細(xì)胞組分可分為8類。同時(shí)對(duì)這些互作蛋白的的最佳匹配物種進(jìn)行了分析，其中12.3％的蛋白與內(nèi)華達(dá)古白蟻（Zootermopsis nevadensis）同源，9.2%與赤擬谷盜(Tribolium castanetum)同源，4.6%可比對(duì)上白背飛虱已知序列，4.6%與致倦庫(kù)蚊（Culex quinquefasciatu）同源，3.5%分別與柑橘木虱（Diaphori

5、na citri）、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）、歐洲熊蜂（Bombus terrestris）和苜蓿切葉蜂（Megachile rotundata）同源。
　　根據(jù)互作蛋白的分子功能、參與的生物過(guò)程以及blast的比對(duì)結(jié)果，選出28種候選蛋白進(jìn)行了酵母雙雜交再次共轉(zhuǎn)驗(yàn)證，β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)顯示25種蛋白與SRBSDV-P10存在互作，其中15種蛋白存在顯著互作。隨后對(duì)這15種蛋白的編碼序列進(jìn)行擴(kuò)增，

6、利用5’RACE試劑盒以酵母雙雜篩選到的序列為基礎(chǔ)獲得了5種蛋白的全長(zhǎng)ORF，分別為囊泡相關(guān)膜蛋白7(VAMP7)、囊泡運(yùn)輸?shù)鞍祝╒tila）、生長(zhǎng)激素誘導(dǎo)的跨膜蛋白（Ghitm）、初生多肽相關(guān)復(fù)合體 alpha亞基和ATP合成酶脂質(zhì)結(jié)合蛋白（線粒體）。進(jìn)一步利用pull-down技術(shù)對(duì)這5種蛋白與SRBSDV-P10的互作進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果顯示其中3種蛋白（VAMP7、Vtila和Ghitm）與 SRBSDV-P10存在互作。
　

7、　我們進(jìn)一步通過(guò)RT-qPCR對(duì)pull-down驗(yàn)證的互作蛋白VAMP7，Vti1a和Ghitm進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果顯示VAMP7和 Ghitm在雄性成蟲中表達(dá)量高，Vti1a在雌性成蟲階段含量豐富。比較分析VAMP7，Vti1a和 Ghitm在白背飛虱6種不同組織(血淋巴、唾液腺、腸、馬氏管、脂肪體和卵巢)轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示VAMP7主要在腸內(nèi)轉(zhuǎn)錄，Vti1a和Ghitm在馬氏管內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平最高。在不同發(fā)育階段和不同組織轉(zhuǎn)錄水平的