南方水稻黑條矮縮病的監(jiān)測(cè)及其病原病毒Pns6與寄主水稻的互作.pdf

1、水稻（Oryza sativa）是我國(guó)的主要糧食作物，病毒病一直是影響我國(guó)糧食穩(wěn)定生產(chǎn)的一個(gè)重要問題。近十年來，多種水稻病毒病相繼爆發(fā)流行，給水稻生產(chǎn)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，其中由一種新的植物呼腸孤病毒---南方水稻黑條矮縮病毒（Southern Rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病尤為重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)這種新病毒的生物學(xué)和分子生物學(xué)進(jìn)行了許多研究，明確了南方水稻黑條矮縮病

2、的地理分布、癥狀、病原性質(zhì)、傳播途徑、品種抗性等生物學(xué)特性，并解析了病毒的基因組結(jié)構(gòu)和少數(shù)編碼蛋白的功能，但是對(duì)于病毒在寄主組織的分布和動(dòng)態(tài)變化、多數(shù)編碼蛋白的功能、病毒的致病機(jī)制、寄主抗感病作用機(jī)制等仍不清楚。因此，保持對(duì)水稻病毒病的監(jiān)測(cè)，了解病毒在寄主體內(nèi)的分布和動(dòng)態(tài)變化，以及研究病毒與寄主間的互作關(guān)系，對(duì)于病毒病的防控以及闡明病毒的致病機(jī)制等方面具有重要的意義。
　　首先，于2009-2012年間，在湖北、福建、江西、湖南、

3、海南等省進(jìn)行了水稻病毒病田間流行調(diào)查，并承擔(dān)了這些省份水稻病毒病的診斷和檢測(cè)任務(wù)，在此基礎(chǔ)上，分析了水稻病毒病的種類、分布和流行特點(diǎn)。結(jié)果如下：首次報(bào)道了南方水稻黑條矮縮病毒在湖北水稻和玉米上的發(fā)生，以及驗(yàn)證了水稻條紋病毒在湖北水稻產(chǎn)區(qū)的存在；福建水稻病毒的種類較多，有SRBSDV、RBSDV(Rice black streaked dwarf virus)、RSV(Rice stripe virus)、RRSV(Rice ragged

4、 stunt virus)、RDV(Rice dwarf virus)、RGSV(Rice grassy stunt virus)，國(guó)內(nèi)流行的水稻病毒病在福建均有分布；湖南和江西兩省是近幾年我國(guó)水稻病毒病發(fā)生的重災(zāi)區(qū)，病原以SRBSDV為主，RRSV次之；海南省是我國(guó)南方水稻黑條矮縮病和水稻鋸齒葉矮縮病的重要初侵染來源地。
　　其次，測(cè)定了 SRBSDV湖北分離物的全基因組序列，并以此序列為基礎(chǔ)擴(kuò)增了病毒13個(gè)基因的全長(zhǎng)，在本氏煙

5、細(xì)胞中分別表達(dá)這些基因，觀察所表達(dá)蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果顯示：SRBSDV湖北分離物全長(zhǎng)29122 bp，基因組核酸S10-S1的登錄號(hào)分別為HM585270-HM585879；P1、P4、Pns52、P91這4個(gè)蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中形成聚集體，Pns52、Pns91能形成較大顆粒狀聚集體，而P1、P4則形成點(diǎn)狀的聚集體；P2、P8、P3、P10這4個(gè)蛋白的定位相似，即可定位于細(xì)胞核，也可以定位于細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞質(zhì)中都能夠形成

6、一些點(diǎn)狀聚集體；P51、Pns6、Pns71、Pns72和Pns92定位相似，分散于整個(gè)細(xì)胞，定位于細(xì)胞質(zhì)中或膜上，沿細(xì)胞骨架等組分形成絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，Pns6和 P51在細(xì)胞質(zhì)中還能夠形成顆粒狀的聚集體。
　　RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)研究了病毒在水稻組織中的分布和動(dòng)態(tài)變化以及種子各組分的帶毒情況。結(jié)果顯示：SRBSDV只存在于韌皮部細(xì)胞中，是一個(gè)韌皮部組織限制的病毒；不同生育期的病株種子各組分都可以帶毒，成熟種子雖可以攜帶S

7、RBSDV，但是不能夠經(jīng)過種子傳播；在水稻幼苗接種病毒后的30天內(nèi)，根組織的病毒含量一直大于地上部分組織，病毒含量在12天或14天內(nèi)增長(zhǎng)比較緩慢，26 d左右時(shí)可達(dá)到比較明顯的水平；幼苗期根組織內(nèi)的病毒含量遠(yuǎn)大于地上部分的葉片和葉鞘，而分蘗期根、葉、葉鞘、莖中的病毒含量差別不大，至揚(yáng)花灌漿期后莖中的病毒含量遠(yuǎn)大于其它部位，進(jìn)一步說明病毒在不同生育期、不同組織中的含量是不同的。
　　最后，以SRBSDV Pns6為誘餌，利用酵母雙雜

8、交系統(tǒng)篩選水稻cDNA文庫(kù)，釣取了24個(gè)可能與之互作的水稻蛋白；從中選取8個(gè)蛋白，經(jīng)過RT-PCR獲得了其完整閱讀框，并將它們重組到酵母載體和BiFC植物表達(dá)載體上，通過酵母菌回復(fù)互作驗(yàn)證和BiFC體系的熒光互補(bǔ)驗(yàn)證，8個(gè)水稻蛋白中有5個(gè)能夠與Pns6互作，這5個(gè)水稻蛋白是40S ribosomal protein S9-2、ubiquitin-conjugating enzyme、AP2 domain containing prote

9、in、zinc finger protein、eukaryotic translation elongation factor1A。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了OseEF1A(eukaryotic translation elongation factor1A from Oryza sativa)與SRBSDV Pns6互作的意義以及OseEF1A與水稻病毒互作的普遍性，取得了如下結(jié)果：（1）SRBSDV Pns6除了與水稻eEF1A互作外

10、，還與自身的基質(zhì)蛋白Pns91互作，共定位實(shí)驗(yàn)表明Pns6可能招募Pns91和OseEF1A形成復(fù)合體，從而在病毒基因組復(fù)制和增殖中起某種作用；（2）RRSV的Pns10和Pns6都能夠與OseEF1A在酵母中互作以及在本氏煙細(xì)胞中共定位，說明和SRBSDV一樣，RRSV能夠利用OseEF1A為病毒基因組復(fù)制和增殖服務(wù)；（3）除上述兩種病毒外，OseEF1A還能夠與RGDV的Pns11，RSV的NS3，RGSV的NS1、NS3和PC3等