水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析及與RBSDV P8互作玉米蛋白的鑒定.pdf

1、玉米是我國重要的糧食作物、飼料作物和工業(yè)原料。病害的發(fā)生給我國玉米生產(chǎn)造成了嚴重損失，其中粗縮病可導致玉米嚴重減產(chǎn)，甚至絕產(chǎn)，是玉米上危害最嚴重的病害之一。引起我國玉米粗縮病的主要是呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟病毒屬（Fijivirus）的水稻黑條矮縮病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)。RBSDV的病原特征、傳播途徑等生物學特性和基因結(jié)構(gòu)以及功能解析已有所研究，但其分子變異、進

2、化機制和致病機理還不十分清楚。由于田間寄主植物和傳毒昆蟲的發(fā)生數(shù)量、帶毒率與玉米粗縮病的發(fā)生密切相關(guān)，了解RBSDV田間寄主，及時檢測傳毒介體灰飛虱的帶毒率，對于制定玉米粗縮病的防控措施具有重要意義;明確影響RBSDV進化的因素，了解病毒在自然條件下的進化趨勢，研究病毒與寄主間的互作，可為抗病品種選育及病毒病的可持續(xù)控制提供理論指導。
　　本研究建立并優(yōu)化了RBSDV的檢測體系，明確了RBSDV的田間寄主，測定了RBSDV重排體S

3、DZZ10的全基因組序列，從山東玉米上檢測到南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV），分析了RBSDV的群體遺傳結(jié)構(gòu)，并鑒定了玉米中與RBSDVP8互作的蛋白。具體結(jié)果如下:
　　1、針對RBSDV的S10片段設(shè)計了4對引物，通過比較不同的Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶用量、退火溫度、檢測引物建立了最佳RT-PCR檢測體系:10×PCRbuffer2.

4、5μL，25mMMgCl21.5μL，dNTP(each2.5mM)2.0μL，檢測引物F4(5'-AGYGAAGAATTTGTAGGTGTG-3')和R4(5'-GTTTCAACAAATGACGCTAC-3')(10μM)各1.0μL,5U/μLTaqDNA聚合酶0.2μL，模板RNA5.0μL，加11.8μL水將體系補至25μL。利用這一體系可以從單頭灰飛虱和30ng玉米樣品提取的總RNA中檢測到病毒的存在，同時從禾本科的牛筋草（E

5、leusine indica）、野燕麥(Avena fatua)、馬唐（Digitaria sanguinalis）、稗草（Echinochloa crusgalli）、狗尾草（Setaria viridis）、狗牙根（Cynodon dactylon），菊科苣荬菜(Sonchus brachyotus)、醴腸（Eclipta prostrata），莧科的反枝莧(Amaranthus retroflexus)等均檢測到RBSDV，首次發(fā)

6、現(xiàn)雙子葉植物苣荬菜、反枝莧也是RBSDV的自然寄主。
　　2、測定了RBSDV分離物SDZZ10所有可讀框(ORF)的序列，與已知的2個RBSDV分離物Hbm和Zir全基因組序列比較，SDZZ10的大多數(shù)ORF與Hbm相應(yīng)ORF的核苷酸序列一致率更高，其蛋白與Hbm相應(yīng)蛋白的氨基酸一致率也更高，但SDZZ10的ORF3，ORF4，ORF9-2和ORF10與Zir相應(yīng)ORF的核苷酸一致率更高，P4，P9-1和P9-2與Zjr相應(yīng)蛋白

7、的氨基酸一致率更高。在ORF8和ORF10的系統(tǒng)進化樹中，SDZZ10分別屬于不同的組，說明SDZZ10是一個自然發(fā)生的重排體。
　　3、測定了南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）分離物JNi4的S7-S10基因序列。JNi4的S7到S10和RBSDV相應(yīng)片段的核苷酸一致率分別為72.6-73.1％，72.3-73％，73.9-74.5％和77.3-79％，與SRBSDVHN和GD分離物相應(yīng)片段的一致率為99.7％，99.1％-9

8、9.7％，98.9％-99.5％和98.6％-99.2％。JNi4在根據(jù)S7到S10基因組序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹中和GD、HN形成一個獨立的分枝。這些結(jié)果證實了SRBSDV作為斐濟病毒屬一個獨立種的觀點，證明JNi4是SRBSDV的一個分離物。山東是目前為止發(fā)生SRBSDV的最北地區(qū)。
　　4、測定了來自山東、江蘇和安徽等地水稻和玉米101個RBSDV分離物的S8(S8包含一個開放閱讀框ORF8，編碼次要衣殼蛋白)和103個分離物的

9、S10（ORF10編碼主要衣殼蛋白）的序列。RBSDV的S8和S10基因處于負選擇。RBSDV三個分離物的S8和兩個分離物的S10存在明確的重組現(xiàn)象。中國RBSDV種群根據(jù)S8基因可以分為3個組，而根據(jù)S10基因可以分為2個組，分組與分離物的地理和寄主來源之間沒有相關(guān)性。在同時獲得S8和S10序列的85個分離物中有17個是組間重排體，30個是亞組間重排體。不同地區(qū)和不同寄主的RBSDV亞種群內(nèi)和亞種群間基因交流頻繁，來自中國玉米的種群處

10、在擴張趨勢。未發(fā)現(xiàn)RBSDV新譜系。這些結(jié)果表明重組、重排、負向選擇壓力及基因交流是影響中國RBSDV進化的重要因素。
　　5、根據(jù)SDZZ10S8序列構(gòu)建了誘餌載體質(zhì)粒pGBKT7-S8，利用酵母雙雜系統(tǒng)從玉米cDNA文庫中篩選與RBSDVP8互作的玉米蛋白。經(jīng)假陽性排除、序列測定以及在GenBank數(shù)據(jù)庫中blast檢索，初步篩選到26種可能互作的蛋白，并進一步證實玉米40S核糖體蛋白S13可以和RBSDVP8互作。為了確定與