水稻黑條矮縮病毒誘導(dǎo)形成瘤狀結(jié)構(gòu)的組織學(xué)特征及基因表達(dá)差異分析.pdf

1、水稻黑條矮縮病毒(RBSDV)是呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）第2亞組成員，其基因組由10條雙鏈RNA組成(S1～ S10)，分別編碼13個(gè)病毒蛋白。RBSDV侵染水稻、玉米分別引起水稻黑條矮縮病和玉米粗縮病，主要在我國華東、華北和西北地區(qū)的糧食作物上流行成災(zāi)，給糧食生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響。RBSDV以灰飛虱（Laodelphax striatellus）作為主要傳播媒介，在灰飛虱取食過程中侵染植物的維管

2、組織，引起寄主植物矮化、瘤狀結(jié)構(gòu)發(fā)生等明顯的病癥。植物維管組織是植物運(yùn)輸有機(jī)物質(zhì)的重要通道，人們對(duì)RBSDV如何在植物維管組織內(nèi)增殖、擴(kuò)散以及誘導(dǎo)葉脈形成瘤狀突起的機(jī)制尚不了解。
　　本研究以感染RBSDV的玉米植株為材料，用酸性品紅等化學(xué)染料染色觀察，結(jié)合免疫膠體金標(biāo)記、免疫熒光標(biāo)記和蛋白組學(xué)分析等方法分析瘤狀結(jié)構(gòu)組織的病理學(xué)特點(diǎn)，研究RBSDV的侵染與玉米植株瘤狀突起發(fā)生之間的聯(lián)系。
　　瘤狀結(jié)構(gòu)的顯微解剖觀察顯示，RB

3、SDV誘導(dǎo)葉脈形成的瘤狀結(jié)構(gòu)存在于維管組織的韌皮部附近，與健康葉脈的組織結(jié)構(gòu)差異明顯，主要表現(xiàn)為韌皮部細(xì)胞大量增生，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，排序結(jié)構(gòu)無序。用酸性品紅等化學(xué)染料對(duì)瘤狀組織的橫切和縱切結(jié)構(gòu)進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)在正常韌皮部組織和增生組織間存在著增厚的細(xì)胞隔層，靠近隔層的早期增生細(xì)胞與成熟篩管分子形態(tài)相似，都沒有細(xì)胞核。正常韌皮部中，無細(xì)胞核的篩管分子(SE)和有細(xì)胞核的伴胞(CC)排列整齊有序，具有固定的細(xì)胞形態(tài)，而增生區(qū)的大多數(shù)細(xì)胞含有較

4、大的細(xì)胞核和豐富的細(xì)胞質(zhì)，分裂活動(dòng)旺盛，具有無限分裂增生的特性。胼胝質(zhì)專一性染料染色結(jié)果和胼胝質(zhì)免疫膠體金標(biāo)記結(jié)果顯示，增生細(xì)胞和韌皮部細(xì)胞的細(xì)胞壁上有少量胼胝質(zhì)產(chǎn)生。根據(jù)以上結(jié)果，瘤狀結(jié)構(gòu)的形成主要由韌皮部細(xì)胞的大量增生引起，增生細(xì)胞的生長(zhǎng)模式跟正常韌皮部細(xì)胞存在差異。
　　在研究RBSDV和瘤狀結(jié)構(gòu)形成之間的關(guān)系中，利用Western blot技術(shù)檢測(cè)病毒在玉米植株內(nèi)的分布情況，結(jié)果顯示RBSDV存在于玉米的根、莖、葉中，表明

5、RBSDV能在玉米體內(nèi)系統(tǒng)性侵染，而且根部的韌皮部也有多個(gè)增生細(xì)胞團(tuán)出現(xiàn)。我們結(jié)合了冷凍切片技術(shù)和免疫熒光標(biāo)記技術(shù)，對(duì)瘤狀結(jié)構(gòu)中的病毒蛋白進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記。結(jié)果顯示，瘤狀葉脈的韌皮部細(xì)胞壁上發(fā)現(xiàn)有熒光素標(biāo)記的病毒蛋白，在根部的韌皮部細(xì)胞和皮層細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)有病毒蛋白存在。玉米的葉脈內(nèi)存在大、小維管束和橫向維管束，韌皮部細(xì)胞增生現(xiàn)象只發(fā)生在大維管束內(nèi)，熒光素標(biāo)記的病毒蛋白發(fā)出的熒光在大、小維管束中均有發(fā)現(xiàn)，推測(cè)RBSDV粒子能夠通過橫向維管

6、束進(jìn)行橫向運(yùn)輸。
　　植物病癥的發(fā)生和形成受到許多基因的調(diào)控，為了篩選出RBSDV誘導(dǎo)玉米葉脈形成瘤狀結(jié)構(gòu)的相關(guān)基因，用蛋白質(zhì)雙向電泳、質(zhì)譜技術(shù)和RT-PCR技術(shù)分析了瘤狀葉脈形成前后表達(dá)發(fā)生變化的因子，篩選得到25個(gè)表達(dá)差異較大的蛋白因子，其中6個(gè)表達(dá)水平發(fā)生上調(diào)，19個(gè)發(fā)生下調(diào)。RT-PCR分析25個(gè)差異蛋白的基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化，發(fā)現(xiàn)有3個(gè)基因上調(diào)，22個(gè)基因下調(diào)。綜合分析25個(gè)差異蛋白在表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平的變化，16個(gè)基因

7、的表達(dá)水平和轉(zhuǎn)錄水平變化一致，其余9個(gè)變化相反。結(jié)合序列鑒定和比對(duì)結(jié)果，其中有10個(gè)蛋白的功能未知，其余15個(gè)表達(dá)差異蛋白的功能與植物生長(zhǎng)、發(fā)育、脅迫應(yīng)答和免疫進(jìn)程等緊密相關(guān)，可能在RBSDV誘導(dǎo)玉米葉脈形成瘤狀結(jié)構(gòu)的過程中發(fā)揮重要的作用。
　　綜上所述，玉米葉脈表面的瘤狀突起主要由韌皮部細(xì)胞大量增生所引起，RBSDV與葉脈上瘤狀結(jié)構(gòu)的形成緊密相關(guān)。本文的研究結(jié)果對(duì)瘤狀結(jié)構(gòu)的形成提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步分析、驗(yàn)證表達(dá)差異蛋白在