禽類(lèi)病毒RNA沉默抑制子的篩選及初步鑒定.pdf

1、RNA沉默(RNA silencing)是一種依賴(lài)核酸序列特異性的抗病毒防御機(jī)制。針對(duì)寄主的這一防御機(jī)制，許多病毒進(jìn)化出相應(yīng)的RNA沉默抑制子。自1998年首次發(fā)現(xiàn)植物病毒編碼的基因沉默抑制因子以來(lái)，已在多種動(dòng)、植物病毒中發(fā)現(xiàn)該類(lèi)蛋白，并對(duì)其中部分蛋白的作用方式進(jìn)行了研究。目前，沉默抑制子的鑒定和作用機(jī)理分析已成為病毒學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。本研究以禽流感病毒的幾種致病蛋白基因?yàn)楹蜻x沉默抑制子，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)這些候選沉默

2、抑制子進(jìn)行鑒定，就沉默抑制子的作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，具體結(jié)果如下： 1.克隆新城疫病毒致病基因F、禽流感病毒致病基因NS1和火雞皰疹病毒HVT基因，分別構(gòu)建其植物雙元表達(dá)載體(pB121)35S-F、35S-IVT和35S-NS1，成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。 2.以pBIN61-P19質(zhì)粒、提取的轉(zhuǎn)GFP本生煙(16c)的總DNA和提純的馬鈴薯X病毒RNA為模板，經(jīng)PCR或RT-PCR擴(kuò)增，分別得到P19、GFP和P

3、25的全長(zhǎng)片段，分別構(gòu)建其植物雙元表達(dá)載體35S-P19、35S-GFP和35S-P25，成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。 3.以35S-GFP+35S-空載體為陰性對(duì)照，35S-GFP+35S-P19和35S-GFP+35S-P25為陽(yáng)性對(duì)照，對(duì)侯選沉默抑制子進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)分析。分別將攜帶候選蛋白基因F、HVT、NS1的農(nóng)桿菌與攜帶35S-GFP的農(nóng)桿菌共侵染，侵染區(qū)表型分析表明F對(duì)GFP表達(dá)沒(méi)有影響，而HVT能誘發(fā)GF

4、P的快速沉默，NS1則能增強(qiáng)GFP的表達(dá)。這說(shuō)明NS1具有沉默抑制子功能。 4.NS1對(duì)系統(tǒng)性沉默的表型觀察中發(fā)現(xiàn)，其不能阻斷系統(tǒng)性沉默信號(hào)。在9 dpi左右，侵染區(qū)仍保持綠色，直至葉片脫落，而新生葉片葉脈開(kāi)始變紅，出現(xiàn)不同程度的系統(tǒng)性沉默癥狀。在32dpi左右，整個(gè)植株系統(tǒng)性沉默。結(jié)果表明NS1能夠有效的抑制局部性沉默，而不能阻斷沉默信號(hào)的系統(tǒng)性傳播。 5.構(gòu)建GFP原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21(DE3)plys

5、S中誘導(dǎo)表達(dá)。以誘導(dǎo)蛋白免疫小白鼠，制備抗血清，測(cè)得效價(jià)為1：1500，可以用于煙草中GFP蛋白的免疫分析。 6.分別提取35S-空載體、35S-P19、35S-NS1與35S-GFP農(nóng)桿菌共侵染區(qū)在3dpi和7dpi的總蛋白，Western blot檢測(cè)侵染區(qū)GFP的含量。在3dpi，空載體侵染區(qū)GFP有一定量的表達(dá)，但在7dpi基本檢測(cè)不到GFP，分析為在3dpi GFP有一定量的瞬時(shí)表達(dá)，在7dpi發(fā)生了GFP的基因沉默。

6、P19和NS1在3dpi和7dpi的侵染區(qū)均能檢測(cè)到高表達(dá)的GFP，這與侵染區(qū)綠色熒光表型一致，分析為NS1像P19一樣作為沉默抑制子能增強(qiáng)外源GFP的表達(dá)量。 7.分別提取35S-空載體、35S-P19、35-NS1與35S-GFP農(nóng)桿菌共侵染區(qū)在3dpi和7dpi的總RNA，Northern blot檢測(cè)侵染區(qū)GFPmRNA的含量。在3dpi，空載體侵染區(qū)GFP mRNA含量明顯低于P19和NS1的侵染區(qū)，而7 dpi侵染區(qū)