中國(guó)番茄黃曲葉病毒衛(wèi)星編碼βC1蛋白的寄主互作因子鑒定.pdf

1、中國(guó)番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leaf curl China virus，TYLCCNV)是一種伴隨有衛(wèi)星DNA的單組份雙生病毒，在自然界以TYLCCNV/TYLCCNVbetasatellite(TYLCCNB)病害復(fù)合體的形式侵染寄主。TYLCCNV/TYLCCNB能夠在番茄和煙草等多種植物上引起曲葉、黃化、葉脈增厚、耳突以及矮化等癥狀，而TYLCCNB互補(bǔ)鏈上編碼的βCl蛋白是癥狀決定因子。
　　 為了更好

2、地了解TYLCCNV/TYLCCNB病毒復(fù)合體在番茄上的致病機(jī)理以及番茄在抵御病毒入侵過(guò)程中產(chǎn)生的防衛(wèi)反應(yīng)，本研究首先通過(guò)提取番茄總RNA并構(gòu)建了番茄cDNA文庫(kù)。隨后以病毒致病因子βCl蛋白為誘餌在番茄cDNA文庫(kù)中篩選與βCl蛋白互作的寄主因子，獲得157個(gè)陽(yáng)性酵母菌落，共包含了113條番茄寄主因子的cDNA信息，其中有48條為功能已知蛋白的cDNA序列。從釣取到的48種潛在互作因子中挑取了10種用于全長(zhǎng)基因的克隆以及與βCl蛋白互

3、作的驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)番茄的一種E3泛素連接酶RING finger蛋白SlRFP和一種絲/蘇氨酸蛋白激酶SlSnRK1能夠與βCl蛋白發(fā)生特異性相互作用。
　　 對(duì)TYLCCNBβCl與番茄RING finger蛋白SlRFP的互作機(jī)制進(jìn)行了初步分析。通過(guò)酵母雙雜交以及雙分子熒光互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)βCl與全長(zhǎng)SlRFP蛋白在體外和體內(nèi)條件下均能夠發(fā)生互作。隨后根據(jù)SlRFP的二級(jí)結(jié)構(gòu)和保守功能區(qū)設(shè)計(jì)了5個(gè)突變體用于分析SlRFP中與βC

4、l蛋白互作的位點(diǎn)，結(jié)果表明SlRFP蛋白的RING tinger結(jié)構(gòu)域(第448～481氨基酸)是βCl蛋白的主要結(jié)合位點(diǎn)。SlRFP基因在番茄的不同組織中均有表達(dá)但表達(dá)量存在差異，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)SlRFP蛋白是一種核質(zhì)共定位蛋白。通過(guò)熒光定量PCR試驗(yàn)證實(shí)TYLCCNV/TYLCCNB復(fù)合體的侵染能夠?qū)е路裇lRFP基因的表達(dá)量提高。
　　 為了進(jìn)一步分析TYLCCNBβCl與SlSnRK1的互作機(jī)理，根據(jù)SlSnRK1和TYL

5、CCNBβCl的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及保守功能區(qū)分別設(shè)計(jì)了9個(gè)和8個(gè)突變體，用于分析二者互作所需的區(qū)域。酵母雙雜交結(jié)果顯示，TYLCCNBβCl與SlSnRK1的N端激酶結(jié)構(gòu)域(第1～280氨基酸)并不存在明顯的互作，而與SlSnRK1 C端的泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(第281～339氨基酸)和自我抑制結(jié)構(gòu)域(第340～449氨基酸)互作；對(duì)TYLCCNBβCl與SlSnRK1互作的結(jié)構(gòu)域分析表明，βCl蛋白的完整結(jié)構(gòu)是與SlSnRK1互作所必需的。