蘋果褪綠葉斑病毒與蘇俄蘋果互作寄主因子的鑒定及亞細(xì)胞定位.pdf

1、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)是蘋果上危害最大的一類潛隱性病毒，廣泛分布于世界各地。該病毒單獨(dú)侵染或與其它病毒混合侵染嚴(yán)重影響果樹產(chǎn)量及果實(shí)品質(zhì)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究在利用酵母雙雜交技術(shù)篩選能與ACLSV CP、MP互作的蘇俄蘋果寄主因子的基礎(chǔ)上，通過生物信息學(xué)分析，從中選取可能具有重要功能的寄主因子。利用酵母雙雜交、Pull-down技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步互作驗(yàn)證。然后，對

2、ACLSV功能基因CP、MP及互作寄主基因Malus15-1進(jìn)行了亞細(xì)胞定位。本研究結(jié)果將為揭示寄主基因在ACLSV侵染過程中具有的生物學(xué)功能及兩蛋白互作的意義奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用酵母雙雜交技術(shù)驗(yàn)證了蘇俄蘋果寄主因子Malusl5-1、Malus40-5與ACLSV CP、MP的互作。首先，構(gòu)建帶有完整寄主基因Malus4-1、Malusl5-1、Malus40-5、Malus72-3、Malus85-1、M

3、alus86-1的酵母雙雜交表達(dá)載體。然后，利用共轉(zhuǎn)化法將誘餌載體pGBKT7-CP、pGBKT7-MP與帶有上述6種寄主基因的酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至酵母菌株Y2Hgold中，將共轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于四缺（SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal）培養(yǎng)基上，觀察酵母的生長及顯色情況，驗(yàn)證寄主功能基因與寄主基因之間的互作。結(jié)果表明寄主因子Malus15-1、Malus40-5在四缺平板上菌落呈明顯藍(lán)色，證明CP、MP與寄主因子M

4、alus15-1、Malus40-5互作。
　　2.利用Pull-down技術(shù)驗(yàn)證了ACLSV CP、MP與寄主因子Malus15-1之間的相互作用。首先，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a-CP、pET28a-MP、pET28a-15-1和pET28a-40-5，然后將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。采用Pull-down方法，將洗脫產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE、Western blot檢測蛋白間

5、的互作。結(jié)果表明，以CP為誘餌捕獲Malus15-1蛋白，洗脫產(chǎn)物中有21.5 kDa、16 kDa兩條明顯條帶;以MP蛋白為誘餌捕獲Malus15-1蛋白，沈脫產(chǎn)物中有50.8 kDa、16 kDa兩條條帶，證明CP、MP與Malus15-1之間存在直接相互作用。同樣分別以CP、MP為誘餌捕獲Malus40-5蛋白，沈脫產(chǎn)物中僅有一條條帶，證明CP、MP與Malus40-5蛋白之間無相互作用。
　　3.揭示了ACLSV MP、C