蘋果褪綠葉斑病毒互作寄主因子的篩選.pdf

1、蘋果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)是蘋果生產(chǎn)上為害最大的潛隱性病毒之一，廣泛分布于世界各地，該病毒單獨(dú)侵染或與其它病毒混合侵染可致使樹勢衰弱，發(fā)生慢性病害，嚴(yán)重影響果樹的生長和產(chǎn)量。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對ACLSV生物學(xué)特性進(jìn)行了較為廣泛的研究，但多從病毒本身出發(fā)，基本明確了該病毒的危害癥狀、血清學(xué)特性和分子變異等特征，病毒所編碼蛋白的功能作用、病毒的致病機(jī)制及病原與寄主互作機(jī)制

2、等還不是很明確，與病毒互作寄主因子的研究存在欠缺。因此，本研究在構(gòu)建蘇俄蘋果(Malus sylvestris cv.R12740-7A)cDNA文庫的基礎(chǔ)上，利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與ACLSV互作的蘇俄蘋果寄主因子，并對其功能進(jìn)行分析，從而為揭示病毒的致病機(jī)制、病毒對寄主生長發(fā)育的調(diào)控情況和寄主對病毒的抗感應(yīng)答反應(yīng)奠定基礎(chǔ)，為果樹抗病毒種質(zhì)資源的開發(fā)提供理論依據(jù)。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、以蘇俄蘋果(Malus sylves

3、tris cv.R12740-7A)組培苗為材料，構(gòu)建了以真核表達(dá)載體pGADT7為基礎(chǔ)的蘇俄蘋果酵母雙雜交cDNA文庫。通過異硫氰酸胍法提取了組培苗的總RNA，分離純化得到了mRNA，通過SMART法合成dscDNA，dscDNA經(jīng)酶切與pGADT7文庫質(zhì)粒載體連接，電轉(zhuǎn)大腸桿菌DH10B，經(jīng)涂板檢測，初始文庫滴度為2.67×105 cfu/mL，庫容量為4.0×106 cfu，隨后將文庫進(jìn)行了百萬擴(kuò)增，擴(kuò)增后文庫滴度為1.0×108

4、 cfu/mL，庫容為1.5×1010 cfu，在文庫中隨機(jī)挑取46個(gè)克隆，PCR鑒定插入片段，1kb以上的片段測得大于75％，且重組率為100％，說明文庫質(zhì)量較高，符合文庫構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的展開奠定了基礎(chǔ)。
　　2、以pGBKT7載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建了ACLSV外殼蛋白(coat protein，CP)和運(yùn)動蛋白（movement protein，MP）酵母雙雜交誘餌載體。通過RT-PCR獲得ACLSV CP、MP功能蛋白完整基

5、因序列，通過酶切連接構(gòu)建到pGBKT7載體上，獲得重組子pGBKT7-CP和pGBKT7-MP，測序驗(yàn)證序列準(zhǔn)確性，轉(zhuǎn)化到酵母菌Y2H gold中，進(jìn)行毒性試驗(yàn)和自激活活性檢測，證明了誘餌載體無毒性及自激活活性，可作為后續(xù)酵母雙雜交誘餌載體。
　　3、以ACLSV CP和MP為誘餌蛋白，從蘇俄蘋果cDNA文庫中篩選到79個(gè)互作靶基因，通過生物信息學(xué)分析，其中13個(gè)在與病毒互作過程中起重要作用。采用PEG/LiAc法順序轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，將

6、誘餌質(zhì)粒pGBKT7-CP和pGBKT7-MP分別轉(zhuǎn)化到酵母菌Y2H Gold中，再將蘇俄蘋果cDNA文庫質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到含有誘餌質(zhì)粒的酵母菌中，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于二缺、三缺和四缺營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，挑取四缺培養(yǎng)基上的陽性克隆，提取酵母質(zhì)粒，用pGADT7通用引物進(jìn)行PCR鑒定，選取cDNA插入片段大于500 bp的陽性克隆轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，涂布LB（100μg/mL Amp）平板，挑取陽性克隆，再次進(jìn)行菌落PCR鑒定，鑒定結(jié)果一致的克隆進(jìn)行測