胡蔥黃條病毒陜西洋蔥分離物基因組全序列及編碼的P3蛋白與寄主互作的初步研究.pdf

1、在陜西洋蔥上發(fā)現(xiàn)了一種引起畸形黃條癥狀的病害，本文采用馬鈴薯 Y 病毒科簡(jiǎn)并引物結(jié)合基因特異引物的方法，擴(kuò)增并測(cè)定了侵染陜西洋蔥的病毒基因組eDNA全序列。該病毒基因組全序列由10 427個(gè)核苷酸組成，具有單一開(kāi)讀筐，編碼一個(gè)由3 340個(gè)氨基酸組成的分子量379.7kD的多聚蛋白。序列分析表明該病毒與SYSV-ZQ2分離物同源性最高，核苷酸同源性為93.2％，多聚蛋白的同源性為97.5％，根據(jù)馬鈴薯Y病毒科病毒的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)陉兾餮?/p>

2、蔥上發(fā)現(xiàn)的病毒為SYSV的一個(gè)分離物，命名為為SYS-O。 蛋白裂解位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，除NIb-CP裂解位點(diǎn)外，SYSV洋蔥分離物 O 與大蔥分離物ZQ2的裂解位點(diǎn)完全一致，該位點(diǎn)序列前者為VSYQ/A，而后者為VSYQ/V。編碼的各蛋白均具有Potyvims屬成員特征性的保守基序和活性位點(diǎn)。SYSV-O的外殼蛋白蚜傳保守基序DAG被DAA替換。與OYDV相似，SYSV也編碼獨(dú)特的大P3蛋白，但P3蛋白功能至今尚不清楚。 S

3、YSV-O與SYS-ZQ2編碼的6K1蛋白氨基酸序列完全相同，NIa-Pro、HC-Pro、P3和6K2蛋白也較保守，而NIa．VPg蛋白差異較大，氨基酸序列同源率為93.6％。SYSV-O與其它SYSV分離物CP基因的核苷酸序列同源率為87.3％～84.1％，編碼的蛋白氨基酸序列同源率為89.2％-98.4％。 對(duì)SYSV分離物基因組3'-末端部分核苷酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，SYSV分離物形成4個(gè)明顯的群體。其中印度尼西亞

4、胡蔥分離物成簇為一個(gè)群體，日本大蔥、薤、分蔥分離物和一個(gè)印度尼西亞大蔥分離物成簇為一個(gè)群體，中國(guó)杭州分蔥分離物和中國(guó)章丘大蔥分離物(ZQ2)成簇為一個(gè)群體，中國(guó)杭州大蔥分離物、章丘大蔥分離物(ZQ1)和陜西洋蔥分離物成簇為一個(gè)群體。分離物間的進(jìn)化相關(guān)性與其寄主植物及地理分布有關(guān)。 構(gòu)建了酵母雙雜交載體pGBKT7-(SYSV-O)P3，并成功轉(zhuǎn)入酵母菌AH109。Westernblot分析表明SYS-O的P3蛋白在酵母體內(nèi)與BD

5、蛋白融合表達(dá)，并排除了對(duì)宿主細(xì)胞的毒害和自激活作用，可用于酵母雙雜交文庫(kù)的篩選。 用Trizol提取洋蔥總RNA，應(yīng)用SMART’技術(shù)合成第一鏈cDNA，然后用5'和3'PCR引物進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增雙鏈cDNA，與pGADT7-Rec、pGBKT7-(SYSV-O)P3共轉(zhuǎn)化酵母菌AHl09，根據(jù)對(duì)3個(gè)報(bào)告基因ADE2、HlS3、MELl的檢測(cè)篩選了9個(gè)陽(yáng)性候選克隆。抽提陽(yáng)性候選克隆的質(zhì)粒，PCR檢測(cè)，結(jié)果9個(gè)陽(yáng)性候選克隆的插