CTV強(qiáng)毒分離物對(duì)柑橘基因表達(dá)的影響及其與寄主互作蛋白的鑒定.pdf

1、柑橘是一類重要的經(jīng)濟(jì)果樹，全球年均貿(mào)易額已經(jīng)達(dá)到90億美元。由柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus，CTV)引起的柑橘衰退病被公認(rèn)為柑橘栽培中最具威脅的病毒病害。病毒的成功侵染是病毒與寄主相互作用的結(jié)果，其在復(fù)制增殖過程中產(chǎn)生的病毒蛋白、核酸等分子引起寄主正常生理代謝的改變，并最終導(dǎo)致癥狀的產(chǎn)生。CTV侵染后能夠誘導(dǎo)寄主植物表現(xiàn)莖陷點(diǎn)、苗黃、衰退等明顯癥狀。然而，對(duì)于癥狀表現(xiàn)過程中CTV與寄主互作的分子機(jī)制仍然了解較

2、少。為了分析CTV在轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)水平上對(duì)寄主代謝造成的影響，本研究以CTV強(qiáng)毒株系N21為研究對(duì)象，對(duì)CTV侵染過程中寄主基因的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答反應(yīng)和部分基因的時(shí)空表達(dá)動(dòng)態(tài)進(jìn)行了分析，并對(duì)CTV與寄主間的互作蛋白進(jìn)行了篩選。取得的主要研究結(jié)果如下:
　　 1、以感染CTV-N21并表現(xiàn)莖陷點(diǎn)的墨西哥梾檬以及健康梾檬植株為材料，采用抑制差減雜交技術(shù)(SSH)構(gòu)建了一個(gè)庫容量為14000個(gè)克隆的差減文庫。通過反向Southern雜交篩選，共

3、得到807個(gè)差異表達(dá)EST片段。測序及同源比對(duì)分析結(jié)果表明:這些EST片段代表430個(gè)寄主基因。其中上調(diào)表達(dá)基因282個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因148個(gè)。使用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)隨機(jī)挑選25個(gè)基因在感染CTV-N21墨西哥梾檬植株中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行的定量分析結(jié)果表明:正向文庫中14個(gè)基因上調(diào)表達(dá)倍數(shù)為1.2-10倍，而反向文庫中11個(gè)基因的下調(diào)表達(dá)倍數(shù)為1.1-7倍。以差異表達(dá)1.5倍為選擇標(biāo)準(zhǔn)，則正向和反向文庫的陽性率均在80％以上。對(duì)這430

4、個(gè)基因進(jìn)行功能注釋并依據(jù)分子功能將其分為9類。其中，主要代謝和蛋白質(zhì)代謝所占比例最大，分別占基因總數(shù)的26％和15.1％。在擬南芥數(shù)據(jù)庫Tair中對(duì)這430個(gè)基因進(jìn)行比對(duì)后共找到351個(gè)擬南芥同源基因。蛋白質(zhì)互作預(yù)測結(jié)果顯示這些基因編碼產(chǎn)物在擬南芥代謝中形成復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)。所占比例最大的互作來源于能量代謝。
　　 2、對(duì)6個(gè)防御以及能量代謝相關(guān)基因在墨西哥梾檬不同部位葉片組織中隨CTV侵染時(shí)間(17-177 dpi)的相對(duì)表達(dá)量

5、變化進(jìn)行了分析。3個(gè)防御相關(guān)基因分別編碼幾丁質(zhì)酶(acidic classⅡ chitinase)、奇果類蛋白(miraculin-like protein)和Rsdv抗性類似蛋白(rsdvl resistance like protein);3個(gè)能量代謝相關(guān)基因編碼蛋白為:碳酸酐酶(carbonic anhydrase)、1，5-二磷酸核酮糖脫氫酶(ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygen

6、ase，RuBisCO)以及光捕捉復(fù)合體蛋白Lhca4(light-harvestingcomplexⅠ protein Lhca4)。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示:這些基因的表達(dá)量隨CTV-N21侵染時(shí)間的延長表現(xiàn)出較大的波動(dòng)性，在上部和下部葉片組織中的表達(dá)也存在差異。幾丁質(zhì)酶和奇果類蛋白基因均在接種后97d達(dá)到上調(diào)表達(dá)最大值。但兩者在不同部位葉片中的表達(dá)量均存在差異;Rsdv抗性類似蛋白編碼基因在上部葉片中表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)且呈總表達(dá)量呈

7、持續(xù)下降趨勢，而在下部葉片中則在接種后137d后表現(xiàn)為持續(xù)上調(diào)表達(dá)。光捕捉復(fù)合體蛋白編碼基因在上部和下部葉片中的誘導(dǎo)表達(dá)量總體均呈下降趨勢，并在接種后137d表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。碳酸酐酶和RuBisCO編碼基因總體呈下調(diào)表達(dá)，兩者在不同部位葉片中的表達(dá)量存在較大差異。
　　 3、通過RT-rPCR和體外融合方法分別構(gòu)建了墨西哥梾檬和枳殼的eDNA質(zhì)粒文庫，并利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)CTV與寄主互作蛋白進(jìn)行了篩選。初步篩選得到與病毒蛋白p

8、20和p23互作的3個(gè)寄主蛋白。其在擬南芥中的同源蛋白分別為:碳硫裂合酶(Carbon-sulfur lyases)、蛋白質(zhì)磷酸化酶(Protein phosphatase)和同源結(jié)構(gòu)域亮氨酸拉鏈家族蛋白(Homeodomain leucinezipper familyⅣ protein，HD-ZIP)。BiFC熒光觀察結(jié)果顯示:p20與HD-ZIP沿細(xì)胞壁能夠產(chǎn)生明顯的互作信號(hào)，并在部分區(qū)域大量積累呈亮斑狀。顯示其互作可能發(fā)生在胞間連