兩個(gè)馬鈴薯Y病毒分離物全基因組序列測(cè)定及抗病毒dsRNA表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）、煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是我國(guó)煙草上的主要病毒。甘蔗花葉病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV）引起玉米矮花葉病，嚴(yán)重影響我國(guó)玉米產(chǎn)量。
　　 從山東煙草上分離得到2個(gè)PVY分離物AQ4（JN083841）和FZ10（JN083842），在煙草上引

2、起花葉或斑駁。測(cè)定兩個(gè)分離物的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)AQ4和FZ10均為N和O株系分離物的重組體。AQ4分離物1-496 nt和2497-9700 nt來(lái)源于PVYO株系的分離物Oz,497-2496 nt來(lái)源于PVYN株系的分離物CH-605。FZ10分離物1-496 nt和2497-6533 nt 來(lái)源于PVYO株系的分離物SASA-110,497-2496 nt和6534-9698 nt來(lái)源于PVYN株系分離物CH-605。系統(tǒng)進(jìn)化分

3、析表明，AQ4屬于PVYN:O亞組，F(xiàn)Z10屬于重組的PVYNTN亞組。以前報(bào)道HC-Pro上D205、K400和E419氨基酸決定PVY煙草上引起壞死，F(xiàn)Z10的HC-Pro含這三個(gè)位點(diǎn)，但在煙草上引起花葉，這說(shuō)明可能還有其它基因或位點(diǎn)決定PVY在煙草上引起壞死。
　　 選擇PVY、CMV和TMV的核苷酸序列中適合siRNA形成的保守區(qū)域，以AQ4和實(shí)驗(yàn)室克隆的TMV、CMV cDNA為模板，從PVY CP、CMV RdRp和

4、TMV CP基因上分別擴(kuò)增了300 bp、250 bp和450 bp的片段。以TMV片段中部分序列作為間隔區(qū)域，將三個(gè)片段連接后以反向重復(fù)方式插入pGEM-T Easy載體，得到dsRNA表達(dá)載體。將載體導(dǎo)入RnaseⅢ缺失的大腸桿菌菌株HT115（DE3），誘導(dǎo)表達(dá)后獲得dsRNA。使用表達(dá)dsRNA的細(xì)菌培養(yǎng)液破碎后處理三生煙（N.tabccum cv.Samsun），然后接種病毒，發(fā)病率下降明顯，表明dsRNA培養(yǎng)液有良好的抗病毒

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