抗馬鈴薯Y病毒RNA干擾載體的構建及瞬時表達分析.pdf

1、馬鈴薯病毒性病害是導致馬鈴薯產(chǎn)量下降，品質變劣的主要原因之一，可導致馬鈴薯的利用價值大大降低，已給世界和我國造成了嚴重的損失。目前，利用RNAi(RNA inference,RNAi)技術進行的抗病毒基因工程是抗馬鈴薯病毒的有效手段之一。
　　RNAi是生物體（植物、動物和真菌等）中一種同源性依賴降解特定mRNA的保護機制。RNA介導的抗病毒最有效的策略是通過構建病毒特定基因片段反向重復序列載體轉入植物中，轉錄后生成RNA發(fā)夾結構

2、(hairpin-RNA,hpRNA)，發(fā)夾結構的柄可誘導轉錄后沉默過程(Post-Transcriptional Gene Silencing,PTGS)過程，實現(xiàn)抗病毒目的。因此，構建hpRNA高效表達載體對成功利用RNAi技術培育抗病毒轉基因作物起著至關重要的作用。
　　本研究主要包括兩個部分內(nèi)容，介紹如下：
　　第一部分為貴州不同地區(qū)馬鈴薯Y病毒(potato virus Y,PVY)外殼蛋白（coat protei

3、n,CP）基因的克隆及遺傳分析，這是馬鈴薯抗病毒基因工程重要的前期工作。從中國貴州不同地區(qū)采集感染馬鈴薯Y病毒(PVY)病害葉片，利用試管捕捉RT-PCR(the tube capture RT-PCR,TC-RT-PCR)方法克隆到長度為804bp的8個目的片段，序列分析表明為PVY外殼蛋白(PVY-CP)基因。通過與已經(jīng)發(fā)表的PVY-CP基因序列進行比較和遺傳分析，得出如下結論:
　　1)通過CP基因進行序列分析，可以明確的將

4、PVY三個株系區(qū)分開來，說明利用CP基因去分類PVY是可靠的。
　　2)通過系統(tǒng)樹將本研究分離的PVY，7株鑒定為O株系，1株鑒定為NTN株系，并說明PVYO可能是貴州地區(qū)普遍存在的PVY類群。
　　3)對已報道的PVYO和PVYN進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)兩個株系間有較大的序列差異，并發(fā)現(xiàn)5‘端差異非常明顯，3’端比較保守。同源性分析給予RNAi抗病毒基因工程的靶基因片段的選擇一定的指導性，是重要的前期工作。
　　第二部分

5、主要是探索PVY-CP基因片段的同源性、位置和大小因素對抗病性影響。根據(jù)PVY不同株系CP基因同源性差異，設計了不同大小片段干涉載體，通過瞬時表達分析探索這些載體的抗病毒效率，得出如下結論：
　　1)用于研究同源性的干涉載體pH-Y100-390、pH-Y246-508和pH-Y23-260，研究位置影響的干涉載體pH-Y451-750和pH-Y246-508都獲得較高的抗病性，差異不明顯。
　　2)通過對選擇片段大小不同的

6、載體pH-Y246-508、pH-Y330-528、pH-Y386-528和pH-Y404-507的抗病性的研究，發(fā)現(xiàn)選擇片段為104bp的載體pH-Y404-507出現(xiàn)抗病性明顯降低的現(xiàn)象，而其他三個載體都獲得了100％抗病率。因此，本研究初步將將能引起高效抗性的最短片段定位到104-143bp之間，這為進一步的研究多抗轉基因研究奠定了一定的理論基礎。
　　3)通過以pHellsgate12和pROKII為基礎構建的PVY干涉載