番茄PG基因RNA干擾載體的構建及轉基因研究.pdf

1、番茄是我國的主要果蔬之一，屬于呼吸躍變型果實(Climacteric fruits)，成熟后貯藏期短，依靠生物技術改良番茄的耐貯性對農業(yè)生產和農產品銷售極其重要。多聚半乳糖醛酸酶(PG)是在果實成熟過程中特異表達的細胞壁水解酶，是一種細胞壁結合蛋白，它的主要功能是將果實細胞壁中多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖和醛酸，使細胞壁結構解體，導致果實的軟化。RNA干擾(簡稱RNAi)是近幾年發(fā)展起來的一項使真核生物功能基因表達水平降低或關閉的先進的生

2、物技術，以其特異性、高效性和廣泛性的優(yōu)勢，逐漸成為一項極具潛力的基因功能研究技術。
　　 本研究分別克隆了PG基因的cDNA序列和啟動子區(qū)的DNA序列，設計其RNA干擾序列并克隆到植物雙元表達載體中，分別通過花粉管通道法和農桿菌侵染法將構建的RNA干擾植物雙元表達載體導入番茄細胞中。以期獲得耐貯轉基因番茄植株，為進一步市場化奠定堅實的前期研究基礎。研究的主要結果概述如下：
　　 根據已發(fā)表的番茄PG基因啟動子的核苷酸序列

3、設計兩對引物，以番茄葉片總DNA為模板，經過PCR擴增得到PG基因全長啟動子序列和5’端缺失序列，然后分別克隆到pUC18載體中。序列分析表明PG基因啟動子全長序列為1415bp，與已發(fā)表序列只有四個堿基的差異，同源率為99％。應用已設計的限制性內切酶酶切位點，將上述兩個片段反向連接，形成PG基因啟動子的反向重復序列，并克隆到中間載體pBluescript SK+中；序列分析表明3’端互補區(qū)段的堿基序列完全一致，在體內轉錄后可以互補配對

4、結合，形成hpRNA結構。隨后，將反向重復序列克隆在植物雙元表達載體pPGN中，構建了PG基因啟動子區(qū)的RNA干擾植物雙元表達載體pNPGIR。并將pNPGIR轉化LBA4404，建成了植物轉化工程農桿菌。
　　 設計兩對引物，用RT-PCR的方法獲得了番茄PG cDNA全長序列和5’端缺失序列，將全長cDNA序列克隆到pBluescript SK+載體中。測序結果表明PGcDNA全長序列為1569 bp，與已發(fā)表的序列只有兩個

5、堿基的差異，同源率為99％。應用已設計的限制性內切酶酶切位點，將上述兩個片段反向連接，形成PG基因編碼區(qū)的反向重復序列，將反向重復序列克隆在植物雙元表達載體pPGN中，構建了PG基因編碼區(qū)的RNA干擾植物雙元表達載體pNCPG5dLIR。并將pNCPG5dLIR轉化LBA4404，建成了植物轉化工程農桿菌。
　　 優(yōu)化番茄5個品種再生體系，其子葉外植體的再生順序為：BD>T4>MFg，TJ544>polish Lim，以BD子葉

6、外植體再生率最高。以BD子葉為外植體，確立了適宜的分化培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％、適宜的生根培養(yǎng)基為MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.05 mg/L+蔗糖3％+瓊脂0.6％、遺傳轉化中適宜的卡那霉素和頭孢霉素的抑菌濃度分別為6.5 mg/L和150 mg/L。
　　 將含pNCPG5dLIR和pNPGIR的根癌農桿菌LBA4404分別轉化預培養(yǎng)2天的BD子葉外植體，當農桿菌生長的OD6

7、00為0.6～0.8之間時，菌液不作稀釋，侵染效果比較好，此時的侵染時間以15 min為宜；共培養(yǎng)2～3天后轉至分壓培養(yǎng)基上進行篩選。分壓培養(yǎng)基的篩選方式為：不定芽分化固體培養(yǎng)基+Kan6.5mg/L Cef100 mg/L→Kan8.0 mg/L Cef100 mg/L→Kan10 mg/L Cef50mg/L→Kan15 mg/L Cef50 mg/L。
　　 利用花粉管通道法介導番茄的遺傳轉化，收獲轉基因種子；確立了轉基因